临床免疫学酶免疫技术.docx

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1、第十章酶免疫技术本章考点1 .酶免疫技术的特点2 .酶免疫技术分类3 .酶联免疫吸附试验(ELISA)4 ,膜载体的酶免疫测定5 .临床应用第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一 种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、 价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中 不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收 高。一、酶和酶作用的底物L辣根过氧化酶(HRP) ： HRP在蔬

2、菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含 糖量约18%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种口卜 咻蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁口卜麻环，在403nm波 长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化 物。后者为固体，作为试剂较比。2方便。许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(TMB) 和ABTS。0PD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用

3、液后稳定性差，而 且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色, 可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS,虽然灵敏度不如0PD和B,但空白值很低。6 .碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD,酶作用 的最适pH为8. 0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为100kD,最适pH为9. 6。一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP) 作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反 应后，黄色可稳定一段时间。在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高

4、于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯 度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均 采用HRPo7 .其他的酶：有葡萄糖氧化酶、半乳糖甘酶和服酶等。B-半乳糖甘酸的底物常用4-甲基伞基 半乳糖甘，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏 感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作 为测定容器，此载体不可发出荧光。胭酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外， 在人体内没有内源酶。二、酶标记抗体或抗原酶标记的抗

5、原或抗体称为结合物(conjugate)。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合， 如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。L戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。一、生物素-亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。二、生物素的理化性质与标记（-）生物素及其活化1 .标记蛋白质氨基的活化生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）2 .标记蛋白质醛基的活化生物素 酰肿（BHZ）和脱化生物胞素（BCHZ）3 .标记蛋白质筑基的活化生物素3- （N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）4.

6、标记蛋白质核酸的活化生物素 常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核昔三磷 酸、BNHS 和 BHZ。（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质 （如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。标记方法：（1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多 采用BHZ。（2）标记酶：以生物素标记HRP为例。标记注意事项：（1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择 相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗

7、原或抗体应有适当的比例；（3） 为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质 结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。2,链霉亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC和胶体金。亲和素的标记（链霉亲和素的标记） （1）HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素-生物素化HRP复合物的制备； （3）亲和素-生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。四、生物素-亲和素系统的应用1 生物素-亲和素系统基本类型

8、及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含 生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复 合物技术（ABC）。另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记 亲和素-生物素法（LAB）。此外，依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体， 又分为直接法BAS和间接法BASo2 .生物素-亲和素系统可用于酶免疫测定、荧光免疫测定等方法中。习题64生物素-亲和素系统（BAS）的特点有A.1个亲和素分子可结合4个生物素分子B. 1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C.生物素易与抗体、

9、酶、多聚核甘酸结合D.亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E.亲和素和生物素有极强的亲和力，答疑编号 500734110101正确答案A、C、D、E戊二醛交联可用一步法（如连接AP）,也可用二步法（如连接HRP）。戊二醛一步法操作简便、有效，而 且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二 步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9. 5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此 法的效率可高于一步法10倍左右。2 .过碘酸盐氧化法：本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧 化为醛基。用硼氢化钠（

10、NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比 例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较 为剧烈，各批实验结果不易重复。按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最 后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体 竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法 较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸镂盐析法操作简便，但效果不如用sephadexg-200凝胶过 滤的好。3

11、 .标记抗体鉴定：通常采用棋盘滴定法进行筛选，见第十九章。三、固相载体酶免疫技术的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。 可作固相载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质 抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式，在测定过程中，它作为载体和 容器，不参与化学反应，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器, 最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0. 6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特 殊

12、的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定 的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8义12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联 或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测, 并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测，包括加 样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。 聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别

13、，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙 烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG （一般为10ng/ml）包被ELISA 板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每 孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0. 8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读 数之差应小于10%o与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割， 价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。为比较不同固相在某一 ELISA测定中的优劣，

14、可用以下方法加以检验：用其他免疫学测定方法选出一 个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的 ELISA操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就 是这一 ELISA测定的最合适的固相载体。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等， 这类测定形式将在本章“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时 固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便,但需配备特殊的仪器。四、免疫吸附剂固

15、相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。由于载体的不同，包被的 方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液(最常用的为PH9.6的碳酸缓 冲液)中，加于ELISA板孔中在4过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体 表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表 面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1%5%牛血清白蛋白包被一 次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭(blocking) o包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不 失去其免疫活性

16、。第二节酶免疫技术的分类酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。近年来标记免疫技 术飞速发展，应用不同标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷，而方法的创建者 往往给同类的方法以不同的名称。因此确知某一方法属于哪一类型，对该方法的正确理解有着重要意义。酶免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检 测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。如将试剂抗原或试剂抗体用可以微 量检测的标记物-酶进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身, 而测定复合物中的标

17、记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。这种酶标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位，另一类用于 液体标本中抗原或抗体的测定。前者属于酶免疫组化技术范畴，后者则称为酶免疫测定(EIA)。酶用作免 疫技术标记物是从抗原定位开始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体 技术相似的结果。20世纪70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。酶免疫技术 一般分成酶免疫组化技术和酶免疫测定两大类。酶免疫组化技术与荧光抗体技术相似，酶标记抗体与组织 切片上的抗原起反应，然后与酶底物作用，形成有色沉淀物，

18、可以在普通光学显微镜下观察。如酶作用的 产物电子密度发生一定的改变.则可用电子显微镜观察，称为酶免疫电镜技术。酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相(homogenous)和 异相(heterogenous)两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。如以标记抗体检测标本中 的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下：Ab*+Agf Ab*Ag+Ab*Ab*Ag代表结合的标记物，Ab*为游离的标记物。如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定 Ab*Ag或Ab*中的标记物的量,从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相

19、法。如在抗原抗体反应后Ab*Ag 中的标记物Ab*失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag与Ab*的分离， 可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有好多种。与放射免疫测 定相类似的液相酶免疫测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测 定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就 可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为ELISA的检测技术成为目 前临床检验

20、中应用较广的免疫测定方法。综上所述，酶免疫技术的分类可概括如图4-10-1。懒楙一询I檄靛T嬲靛-翩皴靛L腓物叫一、均相酶免疫测定L酶增强免疫测定技术（EMIT） ： EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶 的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。 反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。2.克隆酶供体免疫分析：DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如B-D半乳糖甘酶）分子的两个片段. 大片段称为酶受体（EA）,小分子称作酶供体（ED）,两者单独均无酶活性，一定条件

21、下结合形成四聚体 方具酶活性。克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和酶供体（ED） 标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻, 不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶，加入底物 测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。二、异相酶免疫测定异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。依据测定方法是否采用固相材料以吸附 抗原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两类：1 .液相酶免疫测定：其测定灵敏度与放射免疫方法相近，近年有取代放射免疫方法的

22、趋势。2 .固相酶免疫测定：如常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）。第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理酶联免疫吸附实验（ELISA）属固相酶免疫测定方法，其基本原理：在固相载体（如聚苯乙烯反应板） 上包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上，经洗涤使结合的酶标 抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色，根据颜色深浅进行定 性或定量分析。二、方法类型及反应原理ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗 体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，

23、可设 计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形 成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固 相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或 定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标

24、抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中 的抗体。（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相 抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简 化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆 抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect）,类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本 中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果 将低于实际含量

25、。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故 称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载 体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体问接地标记上酶。洗涤后，固相载体 上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人I

26、gG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。（四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体 结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原, 则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结 合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗

27、原与固相载体的结合量减少。参考管中只 加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深 度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定 IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM （包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后 再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）

28、加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白 和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD,每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素 分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H,分子量244.31, 存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生

29、物素-羟基琥珀亚胺酯（BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种 类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大, 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化 的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的 敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固 相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物 素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的

30、抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外， 在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版 第4次印刷（版权归原作者，此初仅为授课之用，不作为出版物）第四节膜载体的酶免疫测定一、斑点-ELISA斑点-ELISA （dot-ELISA）的特点时：以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；底物经 酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维膜上用铅笔划 成4mm义4mm的小格，在每格中央点加抗原12 u 1,成

31、为一个小点。干燥后将每格剪下分别放入ELISA板 孔中，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，即为阳性反 应（图4-10-2）。因硝酸纤维素膜吸附性能强，一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜 条，并在同一张膜条上点有多种抗原，将整个膜条与同一份血清反应，则可同时获得对多种疾病的诊断结 果。斑点-ELISA的缺点是操作麻烦，特别是洗涤的操作很不方便。应用斑点-ELISA的原理，通过特殊工艺已制备出各种试剂，供临床检验用。一般分三种类型：将试 剂膜粘贴在塑料条片，便于洗涤和观察。将试剂膜封在小盒内，膜下垫吸水剂，洗涤液通过膜吸入盒内。 此即斑

32、点免疫渗滤试验。将试剂膜固定在小杠框格中放入特殊的自动分析仪中检测。应用这一系统可做 各种蛋白质、激素、药物和抗生素的定量测定。二、免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test, IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（EITB）,因与Southern早先 建立的检测核酸的印迹方法Southern blot相类似，亦被称为Western bloto免疫印迹法（图4-10-3）分 三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） o抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电 荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只 有在

33、染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上， 选用低电压（100V）和大电流（12A）,通电45min转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不 可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次 与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP 底物为3, 3-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-蔡酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根 据SDS-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高 特异

34、性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的 诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配 合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无 针对病毒的特异性抗体。三、斑点免疫渗滤试验以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上， 以液体渗滤过膜的方式迅速完成。本法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。 双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，

35、也可用SPA或针对金标抗 体的抗抗体充当；间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。斑点免疫层析试验以硝酸纤维素为载体，利用微孔滤膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向 另一端渗移，犹如层析一般。第五节酶免疫测定的应用酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可 测值达ng甚至pg水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。 因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但酶免疫测定在医学检验中 的普及应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。酶免疫测定步骤复杂，试剂制备困

36、难。只有 用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。商品ELISA试剂盒中应包含包被好的固相载体、酶结合物底物和洗涤液等。先进的试剂盒不仅提供全 部试剂成分，而且所有试剂均已配制成应用液，并在各种试剂中加色素，使之呈现不同的颜色。ELISA操作 步骤多，所需试剂也多，这种有色试剂既方便操作又有利于减少操作错误。ELISA所有仪器除定量测定中必 需的出色仪（专用的称为ELISA测读仪）外，洗涤板也极有用。洗涤机的使用不仅省时省工，而且也利于 操作标准化，对中小型实验室是实用且易于接受的。但应注意在采用洗板机前，应先对洗板机的性能加以 检定，确认各孔的洗涤效果是否彻底，且重复性好。半自动

37、和自动化ELISA分析仪亦趋成熟，并在大中型临床检验实验室中取得应用。自动化ELISA分析 仪有开放系统（open system）和封闭系统（close system）两类。前者适用于所有的96孔板的ELISA测 定；后者只与特定试剂配套使用。免疫渗滤试验和免疫层析试验具有简便、快速、单份测定、可立等结果等优点，无需任何仪器设备， 试剂稳定，因此多用于急诊检验。这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（如 诊断传染病的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如hCG等）。目前临床检 验中已开展的项目有hCG、抗HCV和抗HIV、HBsAg等，新项目正在不断

38、发展中。均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。ELISA则应用更为广泛，可用以检测的项目包括以 下几个方面：1 .病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。病毒肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细 菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌利布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。2蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）、 各种血浆蛋白质、同工酶（如肌酸激酶CK-MB）、激素（如hCG、FSH、TSH）。3,非肽类激素如T3、T4、雌激素、皮质醇等。4,药物和毒品如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。习题52 ELISA中最常用的固相

39、载体是A.聚氯乙烯B.聚苯乙烯C.三聚氧胺D.琼脂糖E.尼龙膜u答疑编号 500734100201正确答案B习题53辣根过氧化物酶（HRP）作用的底物是A.邻苯二胺B.四甲基联苯胺C. ABTSD.对硝基苯磷酸脂E.4甲基伞酮一，答疑编号 500734100202正确答案A、B、C答案解析许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（0PD）、四甲基 联苯胺（TMB）和ABTS。0PD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。习题54 ELISA板包被后，最常用的封闭物质是A.人白蛋白B.人球蛋白C.牛血清白蛋白D.牛血清球蛋白E.鼠白蛋白一答疑编号 50

40、0734100203r正确答案c（55-57共用题干）A.酶标抗原B.酶标抗体C.酶标抗抗体D.酶标抗原+抗体E.酶标抗体+抗原习题55竞争法使用的是一答疑编号 500734100204正确答案A习题56双抗体夹心法使用的是-答疑编号 500734100205正确答案B习题57间接法使用的是答疑编号 500734100206正确答案C习题60以下各种ELISA技术中，待测孔（管）最后显色的颜色深浅与标本中待测物质呈负相关的是A.双抗体夹心法B.双位点一步法C.间接法I）.竞争法E.捕获法J答疑编号 500734100207正确答案D答案解析竞争法参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考

41、管颜色深度与待测管颜色深度 之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。其他都是正相关。习题61关于斑点-ELISA的叙述，错误的是A.以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维膜为固相载体B.底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色C.可同时获得对多种疾病的诊断结果D.操作繁琐E.灵敏度比常规ELISA高，答疑编号 500734100208正确答案E习题62关于斑点金免疫渗滤试验双抗体夹心法的叙述，正确的是A.以硝酸纤维素膜为载体B.用胶体金标记抗原C.首先滴加纯化的抗体试剂D.膜中央出现红色斑点为阴性反应E.斑点颜色的深浅提示阳性的强弱J答疑编号 500734100209正确答案A、C、E答案解析首先滴加纯化的抗体试剂，渗滤过膜时标本中的抗原被抗体捕获，再加入金标记抗体与被捕 获在膜上的抗原结合呈色，其颜色颜色的深浅反应抗原量的多少（阳性强弱）。习题63 ELISA可应用于A.病原体及其抗体检测B. Ig补体、肿瘤标志物检测C.非肽类激素检测D.药物检测E.毒品检测，答疑编号 500734100210正确答案A、B、C、D、编号：Q/ZDJ-SC质量手册第A版早 下00目录共2页第1页第0次修改第十一章生物素亲和素免疫放大技术