引物合成与纯化的知识分享.docx

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1、引物合成与纯化的知识分享目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶 联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA 链的合成，由待合成引物的3,端向5端合成延伸，相邻的核昔酸通过3-5磷 酸二酯键连接。1.相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下:1）用三氯乙酸去除固相载体5-羟基的保护基团DMT获得游离的5-羟基;2）将亚磷酰胺保护核甘酸单体与活化剂四氮嘤混合，得到核昔亚磷酸活化中间体，与游离的5-羟基发生缩合反应;3）由于无法保证百分之百的5羟基都参与缩合，可能有极少数5:羟基没有参加反应（少于2%）,可用乙酸酊和1-甲基咪嘤试剂将其终止合成

2、，这种短片 段可以在纯化时分离掉；4）在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳XE。经过以上四个步骤，一个脱氧核苗酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤, 直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT 的颜色可以初步判定合成效率。2 . DNA合成粗产物中含有什么杂质?主要是合成过程中产生的少量失败片段。3 .引物纯化方式有哪些？目前引物常用的纯化方式有：C18脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE 纯化、HPLC纯化。纯化方式详细说明RPC纯化RPC纯化是通过反相净化谑芯(Reverse Phase Cartridge)对引物进行纯

3、化，纯化 原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方 式。反相净化谑芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶，能够很好的吸附DNA,并 且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化 的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。ePAGE纯化ePAGE是利用特异性吸附全序列，去除产品中短序列及杂质的方法，凭借自动批量进 样，纯化等设备，更高效的完成DNA的纯化。纯度可满足大多分子生物于头验需求， 如qPCR、多重PCR、定点突变、RNA干扰(基因构建)、质粒DNA测序、全基因合 成、PCR克隆等。ePAGE凭借自动化，时间短

4、，通量大的特点，以更低的价格和更短 的交付周期，提供与PAGE相近纯度与质量的产品.PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚内烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中 回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯 度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50me)的纯化特别有效。HPLC纯化HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化 或分析时能达到很局的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的有离子交 换(ion-exchange) HPLC和反相(reverse-phase) HPLCO rever

5、se phase HPL C:纯度大于90%; ion exchange HPLC:纯度大于95%,可以有效的去除N1短片 段.HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产 效率不高。表L引物纯化主要方式的介绍4 .引物纯化方式如何选择？一般采用RPC、ePAGE纯化、PAGE、HPLC四种纯化方式，在选择上主要 根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定，表2即从引物长度的角度总结了 以上每一种纯化方法的适用范围。可根据实验需要，选择合适的引物纯化方式。纯化方式引物长度1 5mer1 5 40rner41 59mer60 120mer建议适用范围RPC不适用推荐适用

6、不适用快速、通量大， 常用于PCR、测 序引物等。常用于PCR扩 增、全基因合成 及DNA测序 等。ePAGE不适用推荐适用不适用纯度可满足大多 分子生物学实验 需求。常用于质粒DN A测序、全基因 合成、定点突变 （环状突变）及P CR克隆等。PAGE不适用适用适用推荐常规分子生物学 实脸引物采用RP C纯化或ePAGE 纯化即可；但强 烈建议长链引物 （260mer）选用P AGE纯化.50me以上的 未修饰寡核首 酸，用于定点突 变、克隆、蛋白 结合凝胶迁移电 泳分析、治疗与 诊断用途。HP LC离 子 交 换推荐适用适用不适用对纯化短链引物 （15me）特另（J 有效，但此法纯 化通量

7、小、成本 较高。如实验对 纯度要求非常 高，建议选用HP LC与PAGE双重 精制。小于50mer 的未修饰客 核甘酸,用 于定点突 变、克隆、 蛋白结合凝 胶迁移电泳 分析、治疗 用途；带有疏水基反相适用不适用不适用团的修饰引 物；商业化的诊 断引物或探 针（80% 9 0%纯度）.表2.引物纯化主要方式的适用范围及建议5 .合成的引物5,端是否有磷酸化？合成的引物5端为羟基，没有磷酸基团。如果需要，可以用多核甘酸激酶进 行5,端磷酸化，或者合成时直接在5,或3,端进行磷酸化。6 .最长可以合成多长的引物？引物越长，出现问题的概率就越大。除非有特殊需要，我们建议合成片段长 度不要超过80me

8、r,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品，全长引物的百 分比不会超过40% ,后续处理还会丢失很多，因此最后的产量很低。7 .为何长链引物的收费要比短链引物要高？在合成长链引物时，所需要的试剂比短链引物要多，回收值也相对低一些， 尤其是长度大于90base的引物。由于成本的增加，从而导致价格升高。8 . PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？多数情况是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，可以：1）重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能。2）重新合成引物。9 .测序发现引物有突变是怎么回事？引物合成是一种多步骤的化学反应，每一步的合成效率最高也就是99%，副 产品不可以避免。链越长，突变的频率累加起来就越高。在PCR扩增后克隆测 序的时候，为了节约时间和提高成功率，建议：1）在检测到阳性克隆后准备23个阳性克隆子的菌液，尽量送测2个或以 上克隆，这样成功率将大大提高，也节约很多时间；2）也可以先送测1个克隆，其余两个克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出现个别点突变或缺失，立即将余下的两个克隆送测；3 ）这样得到正确的序列可能性将非常高,并且可以免去重新PCR、连接、克隆以及筛选的一系列实验操作，更省去了很多时间。本文来源生物医学资讯微信公众号，转载并不代表赞同其观点和对其真实 性负责。其版权归原作者所有，如有侵权请联系删除。