抗生素药物的分析 PPT课件.ppt

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1、抗生素药物的分析抗生素药物的分析第一节第一节 概概 述述概念概念：具有抑具有抑制或杀灭微生制或杀灭微生物的一类物质物的一类物质抗生素药物抗生素药物特征：特征：生生物物体体在在生生命命活活动动过过程程中中合合成成的的次次级级代代谢谢产物产物。性性质质不不稳稳定定，易易降降解、聚合解、聚合纯度一般较低纯度一般较低临临床床上上会会引引起起不不良良反应反应临临床床应应用用广广泛泛，影影响大响大p159抗生素抗生素药品质药品质量研究量研究的项目的项目性状及鉴别试验性状及鉴别试验，含量测定或效价测定含量测定或效价测定，酸碱度测定，澄明度，水分或干燥失重，酸碱度测定，澄明度，水分或干燥失重，安安全全试试验验

2、（异异常常毒毒性性），热热原原，降降压压物物质质，无无菌。菌。其其他他检检查查：组组分分、杂杂质质、晶晶型型、比比旋旋度度、灰灰分分、重金属、熔点等。重金属、熔点等。抗生素抗生素药品分药品分析常用析常用的方法的方法物理方法物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等旋光法、紫外、红外、色谱等化化学学方方法法（专专属属性性不不强强）：功功能能团团反反应应，鉴鉴别别和和含含量量的的测测定定。容容量量分分析析法法：酸酸碱碱滴滴定定（青青霉霉素素含含量测定）和碘量法。量测定）和碘量法。生物学方法生物学方法：酶反应、微生物法测定效价：酶反应、微生物法测定效价生物学法和化学及物理化学法生物学法和化学及物理化学法生

3、物学方法：生物学方法：是是以抗生素对细菌的效应（抑制细菌生长或杀菌以抗生素对细菌的效应（抑制细菌生长或杀菌力）作为衡量效价的标准。力）作为衡量效价的标准。优点优点：更能够确定抗生素的：更能够确定抗生素的医疗价值医疗价值。缺点：操作步骤多、测定时间长。缺点：操作步骤多、测定时间长。化学及物理化学法化学及物理化学法：是利用其特有的化学和物理化学性质及反：是利用其特有的化学和物理化学性质及反应而进行测定。应而进行测定。优点优点：适用于化学结构确定的抗生素，迅速、准确、专属：适用于化学结构确定的抗生素，迅速、准确、专属性强。性强。缺点：杂质往往有相同的结构。缺点：杂质往往有相同的结构。第四节第四节 抗

4、生素效价微生物检定法抗生素效价微生物检定法 一、一、微生物检定法定义：微生物检定法定义：是是利利用用微微生生物物发发育育时时对对某某些些物物质质的的特特殊殊依依赖赖性性，按按这这些些物物质质对对微微生生物物生生长长的的影影响响，对对他他们们作作出出定定量量检定检定的方法。的方法。微生物检定法可分为三类：微生物检定法可分为三类：P194 dilute method turbid compare method diffuse method比浊法比浊法琼脂琼脂扩散扩散法法稀释法稀释法第四节第四节 抗生素效价微生物检定法抗生素效价微生物检定法 一、一、微生物检定法定义：微生物检定法定义：是是利利用用微

5、微生生物物发发育育时时对对某某些些物物质质的的特特殊殊依依赖赖性性，按按这这些些物物质质对对微微生生物物生生长长的的影影响响，对对他他们们作作出出定定量量检定检定的方法。的方法。微生物检定法可分为三类：微生物检定法可分为三类：P194 dilute method turbid compare method diffuse method比浊法比浊法琼脂琼脂扩散扩散法法稀释法稀释法优点优点1 1、原理与医疗要求基本一致、原理与医疗要求基本一致2 2、对微生物作用、对微生物作用直接反映其抗菌活性直接反映其抗菌活性缺点缺点1 1、结果是总效价，无法区分多组分、结果是总效价，无法区分多组分2 2、时间长

6、，有一定误差，操作繁杂、时间长，有一定误差，操作繁杂与化学方法相比与化学方法相比:二、抗生素标准效价（二、抗生素标准效价（potency)potency)单位单位牛牛津津单单位位:抑抑制制5050毫毫升升肉肉汤汤培培养养基基中中金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌生长的青霉素的最低含量菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位为一个牛津单位.一一个个牛牛津津单单位位相相当当于于0.6ug0.6ug的的青青霉霉素素钠钠盐盐所所具具有有的的抗抗生生活活力力，1mg1mg青青霉霉素素G G钠钠盐盐含含有有16671667个个牛牛津津单单位位,(IU),(IU)（一）（一）稀释单位稀释单位 (u/ml(u/ml，u

7、/mg)u/mg)将将1mg1mg抗抗生生素素配配成成溶溶液液，在在一一定定条条件件下下进进行行稀稀释释，对对某某一一细细菌菌能能抑抑制制其其生生长长的的最最高高稀稀释释度度，即即为为1mg1mg抗生素中可含有的单位。抗生素中可含有的单位。P159（二）（二）重量单位重量单位 (u/mg)(u/mg)以以抗抗生生物物有有效效成成分分（即即生生理理活活性性部部分分）的的重重量量作为抗生素的单位作为抗生素的单位,称重量单位。称重量单位。如如一一个个链链霉霉素素碱碱单单位位的的重重量量为为1 1微微克克，一一个个青青霉霉素素G G钠钠盐盐单单位位的的重重量量为为0.60.6微微克克。同同一一种种抗抗

8、生生素素的的各各种种盐盐的的效效价价可可根根据据其其分分子子量量与与标标准准盐盐类类进进行换算而得。行换算而得。青霉素G钾盐的理论效价（U/mg）=（U/mg）1 1类似重量单位类似重量单位:以以抗抗生生素素盐盐类类纯纯品品的的重重量量为为单单位位。包包括括无无生生物物活性的酸根和金属离子。活性的酸根和金属离子。2 2重量折算单位重量折算单位 以以与与原原始始的的生生物物活活性性相相当当的的纯纯抗抗生生素素实实际际重重量量为一个单位。为一个单位。3 3特定单位特定单位 以以特特定定抗抗生生素素某某一一批批产产品品的的某某一一重重量量为为一一个个单单位，经有关国家权威机构认可而定位，经有关国家权

9、威机构认可而定.效价测定的方法效价测定的方法：一、稀释法（一、稀释法（dilute method）二、比浊法二、比浊法（turbid compare method）三、琼脂扩散法（三、琼脂扩散法（diffuse method）一、一、稀释法稀释法原理：用液体培养基逐级原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释将抗生素稀释，在各管中加，在各管中加入等量的入等量的试验菌液试验菌液，进行培养，观察抑制细菌生长的，进行培养，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。，从而求得被测抗生素的效价。nX=(T/S)*CX

10、=(T/S)*CnX X样品效价样品效价(U/ml)(U/ml)nT T检品液最大稀释倍数检品液最大稀释倍数nS S标准品液最大稀释倍数标准品液最大稀释倍数nC C标准品液效价标准品液效价(U/ml)(U/ml)试管编号试管编号1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀释倍数稀释倍数标准品标准品供试品供试品2 2-4 4-8 8-1616-3232-+6464+128128+256256+512512+10241024+-：细菌被抑制 +：细菌生长X=(T/S)*C=X=(T/S)*C=（16/3216/32）*40=20 40=20（U/ml)U/ml)检测终点判断：检

11、测终点判断：1、试验菌生长完全抑制试验菌生长完全抑制2、生长、生长50%抑制抑制3、指示剂变色、指示剂变色4、电位差的改变、电位差的改变5、菌种的溶血现象等、菌种的溶血现象等二、二、比浊法比浊法原理：将原理：将一定量的抗生素一定量的抗生素加至接种有加至接种有试验微生试验微生物的液体培养基物的液体培养基内，混匀后，经短期培养内，混匀后，经短期培养（约（约3-4h3-4h），测量），测量培养基浊度培养基浊度，其浊度与细，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定的范围内符合比耳定律。的范围内符合比耳定律。细细菌菌数数、细细菌菌群群体体质质量量又又直直接接

12、受受抗抗生生素素效效价价的影响。的影响。操作流程如图：操作流程如图：影响因素：影响因素：一、影响比浊法的物理因素一、影响比浊法的物理因素 1 1、散射现象、散射现象 2 2、菌液浓度：、菌液浓度：3 3、细菌体大小的变化、细菌体大小的变化二二、培培养养基基：成成分分、酸酸度度、培培养养温温度度、通通气气等等条条件件影影响响。金黄色葡萄球菌，。金黄色葡萄球菌，pHpH在在6.8-7.86.8-7.8。三、培养：温度、振摇。三、培养：温度、振摇。基本要点：基本要点：1 1 培培养养条条件件的的控控制制：试试管管规规格格均均一一 水水浴浴箱箱水水温温均均匀匀，试试管管按拉丁方排列。按拉丁方排列。2

13、2 细菌生长误差的控制：细菌生长误差的控制：3 3 测测量量时时间间的的控控制制：各各管管应应先先充充分分混混匀匀，将将菌菌液液移移入入比比色色皿后静止皿后静止2 2分钟后测定。分钟后测定。三、琼脂扩散法（三、琼脂扩散法（diffuse method）即管碟法即管碟法管碟法原理管碟法原理:抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素的一定浓度抗生素的球型区球型区，抑制试验菌生长，通过透，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈，明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比积或直径成正比。在同样条件下

14、将已知效价的标准品。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈抑菌圈)进进行比较；行比较；当当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及一剂量法、二剂量法及三剂量三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。P196抑菌圈的形成

15、抑菌圈的形成P197（1）D的影响因素：的影响因素：抗生素本身结构、分子量等抗生素本身结构、分子量等 杂质：杂质：琼脂含量：琼脂含量：菌种对抗生素的吸附作用：菌种对抗生素的吸附作用：pH影响分子的形式、影响分子的形式、温度影响扩散温度影响扩散 D增大，增大，r也增大也增大影响抑菌圈半径的因素：影响抑菌圈半径的因素：n（2）T的影响：的影响：n 一般一般T增加，增加，r增大。增大。n（3）M的影响：在一定的范围内，小管内的影响：在一定的范围内，小管内M越大，越大，抑菌圈直径越大。抑菌圈直径越大。n（4）C的影响：的影响：C越小，抑菌圈直径越大越小，抑菌圈直径越大n（5）H的影响：培养基增厚，则抑

16、菌圈减小。的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。操作中要注意：操作中要注意：n1试试验验菌菌种种：挑挑选选合合适适的的敏敏感感菌菌；用用适适宜宜的的菌菌种种保保存存方方法法；定定期期对对菌菌种种分分离离纯纯化化；控控制制菌菌龄龄菌量。菌量。n2培培养养基基：培培养养基基的的成成分分影影响响抑抑菌菌圈圈的的大大小小和和清晰度，清晰度，pH。一剂量法（标准曲线法）一剂量法（标准曲线法）n一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围内，内，抑菌圈的直径抑菌圈的直径随随抗生素浓度的增减而增抗生素浓度的增减而增减减。n抑菌圈的直径与抗生素的对数剂量成线性关抑菌圈的直径与抗生素

17、的对数剂量成线性关系，据此测定抗生素效价。系，据此测定抗生素效价。Y=a+bXY=a+bXY:Y:抑菌圈直径抑菌圈直径A A：截距：截距B B：斜率：斜率X X：抗生素浓度的对数。：抗生素浓度的对数。方方法法：为为了了消消除除平平板板间间的的差差异异，在在每每一一平平板板的的含含菌菌培培养养基基上上放放置置6 6个个小小钢钢管管，相相间间的的3 3个个小小管管内内加加入入抗抗生生素素标标准准品品的的某某一一浓浓度度（CkCk）,产产生生的的抑抑菌菌圈圈直直径径平平均均值值为为 .另另外外3 3个个小小管管内内加加入入标标准准品品的的中中心心浓浓度度（CoCo）,所产生的抑菌圈直径平均值为所产生

18、的抑菌圈直径平均值为 。令令f fk k=f=a+bX f=a+bX标标准准曲曲线线的的制制备备：做做8 8个个浓浓度度，取取2424个个平平皿皿，分分8 8组组，每组每组3 3个取平均值。个取平均值。fkfk对对X X作图。作图。-一剂量法令:fk 与抗生素对数剂量成正比标准品：8个剂量，每个3只平皿样品：至少3只平皿 一剂量法标准曲线示意图X 轴 f fk kY 轴 抗生素的对数剂量二二剂剂量法量法n将抗生素的将抗生素的标标准品及准品及检检品各稀品各稀释释成有一定比例成有一定比例的二种的二种剂剂量（量（2 2：1 1或或4 4：1 1），即高），即高剂剂量和低量和低剂剂量，量，在同一平板上

19、在同一平板上进进行行对对比，根据所比，根据所产产生抑菌圈大生抑菌圈大小小来来计计算算检检品效价品效价的方法。的方法。n效价计算公式：抗生素浓度的对数与抑菌圈直效价计算公式：抗生素浓度的对数与抑菌圈直径呈直线函数关系。根据径呈直线函数关系。根据二直线间抗生素对数二直线间抗生素对数剂量之差，可求得检品的效价剂量之差，可求得检品的效价。二剂量法V:(UH-SH+UL-SL)/2W:(UH-UL+SH-SL)/2 I:log(H/L):效价log=IV/WP200效价计算公式：已知抗生素浓度的对数与抑菌圈直径呈直线函数关系。由于标准品与检品的性质相同，则二者的直线斜率应相等。在浓度相同时，两直线重合，

20、而在浓度有差距是，二直线应该互相平行。SHSH:为为 抗抗 生生 素素 标标 准准 品品 高高 剂剂 量量（dS2dS2）所致的抑菌圈直径）所致的抑菌圈直径SLSL：为为抗抗生生素素标标准准品品低低剂剂量量(dS1)(dS1)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径UHUH：为为抗抗生生素素检检品品高高剂剂量量(dT2)(dT2)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径ULUL：为为抗抗生生素素检检品品低低剂剂量量(dT1)(dT1)所致的抑菌圈直径所致的抑菌圈直径假设假设 K:高剂量高剂量/低剂量（低剂量（2/1 或或4/1）图示的检品与标准品二线间对数剂量之差图示的检品与标准品二线间对数剂量之差如果二线完

21、全平行，则如果二线完全平行，则S应与应与UH SH、UL SL相等。实际上，二线不一定完全平行，故应相等。实际上，二线不一定完全平行，故应求平均值：求平均值：则：则：则：则：（1）（2）将（将（2）代入（）代入（1）：）：再乘以标准品与检品的剂量比再乘以标准品与检品的剂量比(D),通常为通常为1，得二剂量法的效价计算公式：，得二剂量法的效价计算公式：P203双碟号SHSLUHUL122.818.822.819.05222.8518.422.118.65322.118.923.118.65423.218.5523.118.6523.018.222.319.6举举例：某批青霉素效价例：某批青霉素效

22、价测测定，定，标标准品准品S2S2、S1S1为为1.0 U/ml1.0 U/ml、0.5 U/ml0.5 U/ml；供；供试试品品T2T2、T1T1浓浓度大度大约约与与标标准溶液相当，准溶液相当，试验试验菌种：金黄色葡萄球菌（菌种：金黄色葡萄球菌（2600326003），），试验结试验结果如下表：果如下表：要求：要求：1、高剂量抑菌圈直径应为高剂量抑菌圈直径应为2024mm，个别，个别可为可为1824mm，高剂量与低剂量抑菌圈直，高剂量与低剂量抑菌圈直径之差应大于或等于径之差应大于或等于2mm。2、底层琼脂、底层琼脂20ml，上层，上层5ml，每一检品所用每一检品所用平板不少于平板不少于4个个

23、。3、等距安置小钢管、等距安置小钢管4个，相对角为同一物质。个，相对角为同一物质。4、为为10010%（更精确要求更精确要求1005%）5、标准品与检品同质、标准品与检品同质V:(U3+U2+U1-S3-S2-S1)/3W:(U3-U1+S3-S1)/4K:剂量间比值(1:0.8)I:logk:效价log=IV/W三剂量法：三剂量法：即应用高、中、低三种剂量，在同一实验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈大小，以求得检品效价的方法要求：要求：1、标准品中剂量抑菌圈直径、标准品中剂量抑菌圈直径1518mm2、高、中、低剂距为、高、中、低剂距为1:0.83、每一检品不得少于、每一检品不得少于6个平皿

24、个平皿4、每板上等距安放小钢管、每板上等距安放小钢管6个个5、:10010%（100%5%）影响抗生素效价管碟法测定结果的因素影响抗生素效价管碟法测定结果的因素（一）（一）影响抑菌圈形状的因素与控制影响抑菌圈形状的因素与控制 1稀释抗生素用的缓冲液的稀释抗生素用的缓冲液的pH值、盐浓度的影响值、盐浓度的影响.pH值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵圆值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵圆形抑菌圈形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或pH值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，影响值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，影响了抗生素对试验菌抑制作用。了抗生素对试

25、验菌抑制作用。2制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的影制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的影响响 3测试用的器材洗净度的影响测试用的器材洗净度的影响 4.双碟双碟培养温度培养温度的影响的影响 5.其他操作的影响其他操作的影响（二）影响（二）影响抑菌圈边缘清晰度抑菌圈边缘清晰度的因素与控制的因素与控制 1 试验菌长时间放置、试验菌长时间放置、菌量菌量 2 培养基培养基的原材料品种与质量，生测用培养基的的原材料品种与质量，生测用培养基的原材料的选择很重要。原材料的选择很重要。3调节培养基的调节培养基的pH值值或增加适量的或增加适量的盐浓度盐浓度可使抑可使抑菌圈清晰菌圈清晰.4不适当延长双碟的不

26、适当延长双碟的培养时间培养时间，使抑菌圈边缘不，使抑菌圈边缘不清。清。抗生素效价管碟法测定的操作技术抗生素效价管碟法测定的操作技术操作分为八步：操作分为八步：1 1 试验菌试验菌的纯化与悬液的制备的纯化与悬液的制备2 2 缓冲液、灭菌水与缓冲液、灭菌水与培养基的制备培养基的制备3 3 标准品、供试品的称量、溶解与稀释标准品、供试品的称量、溶解与稀释4 4 双碟的制备及放管双碟的制备及放管5 5 滴加药液滴加药液6 6 恒温培养恒温培养7 7 测量抑菌圈直径或面积测量抑菌圈直径或面积8 8 计算计算操作流程：操作流程：四、比浊法与管碟法比较四、比浊法与管碟法比较比浊法比浊法管碟法管碟法优点优点

27、1、快速、快速1、结果较稳定、结果较稳定2、客观、精确、客观、精确2、大批量、大批量3、无扩散影响、无扩散影响缺点缺点 1、对样品洁净度、对样品洁净度要求高要求高1、扩散因素影响较、扩散因素影响较大大2、实验要求较严、实验要求较严2、时间长（、时间长（2天天)3、操作繁琐、操作繁琐,人为因人为因素的干扰素的干扰第四节第四节 抗生素效价微生物检定法抗生素效价微生物检定法n一、稀释法一、稀释法 二、比浊法二、比浊法 三、琼脂扩散法三、琼脂扩散法 管碟法原理及操作步骤：管碟法原理及操作步骤：影响抑菌圈半径的因素：影响抑菌圈半径的因素：三、琼脂扩散法三、琼脂扩散法n一剂量法（标准曲线法）一剂量法（标准

28、曲线法）n二剂量法二剂量法n三剂量法三剂量法第五节第五节 生物统计法在抗生素效价生物统计法在抗生素效价检定中的应用检定中的应用n以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品与相当的运用特定的实验设计，通过供试品与相当的标准品或对照品在标准品或对照品在一定条件下比较其产生特一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量间比例定生物反应的剂量间比例，从而测定供试品，从而测定供试品的生物活性。的生物活性。n同时进行试验同时进行试验可靠性测验可靠性测验，可信限计算可信限计算等统计等统计分析。分析。第五节第五节 生物统计法在抗生素效价生物统计

29、法在抗生素效价检定中的应用检定中的应用n以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品与相当的运用特定的实验设计，通过供试品与相当的标准品或对照品在标准品或对照品在一定条件下比较其产生特一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量间比例定生物反应的剂量间比例，从而测定供试品，从而测定供试品的生物活性。的生物活性。n同时进行试验同时进行试验可靠性测验可靠性测验，可信限计算可信限计算等统计等统计分析。分析。量反应平行线测定实验设计类型量反应平行线测定实验设计类型 1.随机设计；不同剂量所致变异随机设计；不同剂量所致变异n2.随机区组设计

30、随机区组设计 n各剂量的区组数（各剂量的区组数（m，碟数）相等，因此在安，碟数）相等，因此在安排时要使每个区组的容量（排时要使每个区组的容量（K，剂量数和）相，剂量数和）相等。等。n抗生素效价测定（管碟法）采用随机区组设计。抗生素效价测定（管碟法）采用随机区组设计。可靠性测验目的可靠性测验目的 n抗生素效价测定属于量量反应平行线测定反应平行线测定n计算原理是以以S和和T的对的对数剂量与反应呈直线关数剂量与反应呈直线关系以及系以及S和和T两条直线平两条直线平行为基础行为基础。可靠性测验方法可靠性测验方法n抗生素效价测定中，存在有抗生素效价测定中，存在有S和和T的差别，直线及平行的差别，直线及平行

31、线关系，剂量间和双碟间的关系。线关系，剂量间和双碟间的关系。n通过统计以上各组均数间的方差，以通过统计以上各组均数间的方差，以试品间、回归、试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）剂间（列）、碟间（行）的方差与误差项（的方差与误差项（S2）的比值（称的比值（称F值）值），来确定各自差异的显著性程度和实，来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性。验结果的可靠性。nF值（值（F值值=该项方差该项方差/误差项误差项S2）可作为观察实验显著）可作为观察实验显著性程度的一个指标。性程度的一个指标。可靠性测验结果分析可靠性测验结果分析（1）试品间（）试品间（F1）：本项是用以观察）：本项是用以观察S和和T

32、的结果是否是显著差别。的结果是否是显著差别。（2）回归（）回归（F2）：当）：当P0.05）。）。n归纳如下：n试品间差异不显著（试品间差异不显著（P0.05）n回归项非常显著（回归项非常显著（P0.05）n剂间差异显著（剂间差异显著（P0.05）。）。四环素片效价测定四环素片效价测定（2.2）法法nS：国家标准品：国家标准品n稀释液浓度：稀释液浓度：ds2=40u/ml；ds1=20u/mlnT：供试品，标示量：供试品，标示量25万万u/片，按标示量配制稀释片，按标示量配制稀释液。液。n稀释液浓度：稀释液浓度：dT2=40u/ml；dT1=20u/mlnr（剂距）（剂距）=2 1nI=log

33、r=log2=0.30103ny（反应值）（反应值）=抑菌圈直径抑菌圈直径M 碟数碟数 k 剂量数和剂量数和 自由度自由度 试品间差异不显著（试品间差异不显著（P0.05）回归项非常显著（回归项非常显著（P0.05）剂间差异显著（剂间差异显著（P0.05）F=方差方差/S2 变异性自由度变异性自由度/误差项自由度误差项自由度效价计算效价计算可信限（可信限（FL）第二节第二节 抗生素类药物的鉴别抗生素类药物的鉴别鉴别杂质鉴别杂质含量含量-内酰胺类内酰胺类利福霉素类利福霉素类氨基糖苷类氨基糖苷类四环类四环类多肽类多肽类大环内酯类大环内酯类一、一、-内酰胺类抗生素的鉴别内酰胺类抗生素的鉴别分类：青霉

34、烷类（四氢噻唑五元环），分类：青霉烷类（四氢噻唑五元环），头孢烯类头孢烯类（二氢噻（二氢噻嗪），碳青霉烯类（硫霉素），嗪），碳青霉烯类（硫霉素），克拉维酸克拉维酸（五元环中的（五元环中的硫被氧代替，且六位没取代基）。硫被氧代替，且六位没取代基）。结构的共同点结构的共同点：1 1、和内酰胺相邻的碳原子上有、和内酰胺相邻的碳原子上有一羧基一羧基。2 2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。P162n青霉素有三个手性碳，头孢有两个手性碳，有青霉素有三个手性碳，头孢有两个手性碳，有旋光性。旋光性。n青霉素青霉素G及头孢有紫外吸收。及头孢有紫外吸收。

35、n青霉素在青霉素在酸碱或青霉素酶的作用下均会发生降酸碱或青霉素酶的作用下均会发生降解解。n头孢类相对稳定。头孢类相对稳定。鉴别：鉴别：1 1、酶法：、酶法：-内酰胺酶内酰胺酶2 2、红外吸收光谱法：、红外吸收光谱法：3000-2800(C-H),3350cm3000-2800(C-H),3350cm-1-1(N-(N-H),1800-1600(H),1800-1600(羰基羰基)，1460-13751460-1375（甲基或次甲基）（甲基或次甲基）3 3、紫外吸收光谱法、紫外吸收光谱法4 4、茚三酮反应：茚三酮反应：是是氨基的反应，与茚三酮缩合，氨基的反应，与茚三酮缩合，生成生成蓝紫色化合物蓝

36、紫色化合物 5 5、与斐林试剂反应、与斐林试剂反应 类似肽键（类似肽键（-CONH-CONH-）结构，可产生）结构，可产生双缩脲反应。开环分解使双缩脲反应。开环分解使碱性酒石酸铜盐还原显紫色碱性酒石酸铜盐还原显紫色。6 6、色谱法：、色谱法：薄薄层色色谱后，后，氯铂酸与硫酸与硫醚基反基反应是灵敏度是灵敏度高的高的显色色试剂 含量测定含量测定药典收载方法，如HPLC、碘量法碘量法、汞量法汞量法、酸碱滴定法酸碱滴定法、紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法等含量测定含量测定 HPLCn色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；n以有关物质项下流动相A-流动相B（7030）为流动相，检测波长为225n

37、m；n测定法 取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；n另取青霉素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，其结果乘以1.0658，即为供试品中C16H17N2NaO4S的含量。n其他检查：n青霉素聚合物:二、氨基糖苷类抗生素二、氨基糖苷类抗生素环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。链霉素链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。（一）鉴别（一）鉴别1、茚三酮反应：、茚三酮反应：蓝紫色化合物蓝紫色化合物2、坂口反应（坂口反应（sagaguchi te

38、st)：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，链霉胍，8-羟喹啉分别与羟喹啉分别与次溴酸钠次溴酸钠反应，其各自的产物在相互反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。作用生成橙红色化合物。3、糖类反应糖类反应：莫利西反应：莫利西反应(Molisch test)，五碳糖，五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成羟甲基糠醛羟甲基糠醛，与蒽酮显蓝色，与蒽酮显蓝色，与与-奈酚呈红紫色。奈酚呈红紫色。4、埃尔松埃尔松-摩根（摩根（Elson-Morgan test)：样品在强酸或强碱水解后释放出样品在强酸或强碱水解后释放出氨基己糖氨基己糖，在碱性条，

39、在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯的衍生物，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯的衍生物，在碱性条件下与件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液（Ehrlich试剂）试剂）成红色，在成红色，在540nm处可定量测定。处可定量测定。5、麦芽酚反应麦芽酚反应(maltol test)：水解、重排水解、重排 Fe3+链霉素链霉素 麦芽酚麦芽酚 紫红色络合物紫红色络合物 OH-H+（二）含量测定（二）含量测定（微生物法微生物法）三、四环类抗生素三、四环类抗生素定义：含有氢化四骈苯的具有抗菌活性的一类化定义：含有氢化四骈苯的具有抗菌活性的一类化合物。合物。作用机理为阻止蛋

40、白质的合成和肽链的延伸。作用机理为阻止蛋白质的合成和肽链的延伸。四环素四环素，土霉素，金霉素，强力霉素。，土霉素，金霉素，强力霉素。理化性质：理化性质：n黄色结晶黄色结晶n功能团功能团：4位二甲胺基，酰胺基，酚羟基，两个含位二甲胺基，酰胺基，酚羟基，两个含有酮和烯醇基的共扼双键系统有酮和烯醇基的共扼双键系统（这两个系统决定（这两个系统决定抗生素的颜色和紫外吸收，前抗生素的颜色和紫外吸收，前350nm后后265nmn成两性化合物性质成两性化合物性质，遇酸碱结合成盐，遇酸碱结合成盐n固体性质稳定金霉素在固体性质稳定金霉素在20 3-5年效价不变。年效价不变。n对各种氧化剂不稳定，在碱性溶液中最易氧

41、化，对各种氧化剂不稳定，在碱性溶液中最易氧化，溶液颜色加深可用于鉴别。溶液颜色加深可用于鉴别。（一）（一）呈色反应呈色反应 1、浓硫酸反应、浓硫酸反应 四环素四环素 深紫色；深紫色；金霉素金霉素 蓝色至绿色；蓝色至绿色；土霉素土霉素 朱红色；朱红色；强力霉素强力霉素 黄色；黄色；2、三氯化铁反应：、三氯化铁反应：酚羟基酚羟基（二）（二）荧光反应荧光反应:土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光（三）紫外光谱（三）紫外光谱（四）色谱（四）色谱 四、大环内酯抗生素（四、大环内酯抗生素（microlides）结构：一个大环内酯环为母核，通过糖苷键与结构：一个大环内酯环为母核，通过

42、糖苷键与1-31-3个糖相连。个糖相连。（红霉素，阿奇霉素，螺旋霉素）红霉素，阿奇霉素，螺旋霉素）鉴别鉴别（一）呈色反应（一）呈色反应 1、硫酸反应：、硫酸反应：遇硫酸均呈红棕色遇硫酸均呈红棕色 2、莫利西反应：糖类的反应、莫利西反应：糖类的反应 3、Seliwanaff 反应：反应：脱水脱水 间苯二酚间苯二酚糖糖 糖醛衍生物糖醛衍生物 具颜色产物具颜色产物 红霉素红霉素 淡黄色；淡黄色；螺旋霉素螺旋霉素 亮紫红色；亮紫红色；碳霉素碳霉素 深青紫色；深青紫色；柱晶白霉素柱晶白霉素 淡青色；淡青色；（二）薄层色谱（二）薄层色谱 (三三)光谱学鉴别光谱学鉴别 紫外光谱紫外光谱 红外光谱红外光谱五、

43、利福霉素类抗生素的鉴别五、利福霉素类抗生素的鉴别结结构构：一一个个脂脂肪肪链链经经过过酰酰胺胺键键与与一一个个平平面面的的芳芳香香基基团团连接成一个环桥式化合物，所以又称环桥类抗生素。连接成一个环桥式化合物，所以又称环桥类抗生素。代表药物：利福平（代表药物：利福平（rifampicinrifampicin）鉴别：鉴别：呈色反应：呈色反应：1 1 浓盐酸反应：浓盐酸反应：2 2 三三氯氯化化铁铁：，向向1ml1ml利利福福霉霉素素的的溶溶液液中中，滴滴加加三三氯氯化化铁铁乙乙醇溶液，有绿色，蓝绿色。表明有醇溶液，有绿色，蓝绿色。表明有酚羟基酚羟基3 3 硝硝酸酸盐盐反反应应：利利福福平平，溶溶液

44、液中中加加入入硝硝酸酸钠钠溶溶液液，颜颜色由橙色变为暗红色。色由橙色变为暗红色。六、六、多肽类抗生素多肽类抗生素：含含有有多多种种氨氨基基酸酸经经肽肽键键缩缩合合而而成成的的一一类类抗抗生生素素。可可由由放放线菌、真菌或细菌产生。线菌、真菌或细菌产生。具有以下特征：具有以下特征：1 1分子量较低，分子量较低，500-1500500-1500。2 2在动植物中常见的氨基酸很少出现，如蛋氨酸、组氨酸等。在动植物中常见的氨基酸很少出现，如蛋氨酸、组氨酸等。3 3常含有稀有氨基酸。常含有稀有氨基酸。4 常含类脂化合物。常含类脂化合物。5 常含常含D-氨基酸氨基酸。6不能为动植物来源的多肽酶（不能为动植

45、物来源的多肽酶（peptidase）所水解。）所水解。7生物合成过程中，类似物多，分离困难。生物合成过程中，类似物多，分离困难。短杆菌肽短杆菌肽：线状的多肽：线状的多肽放放线线菌菌素素：有有酰酰胺胺键键和和内内酯酯键键（用用于于癌癌症症治治疗疗的的放放线线菌菌素素D D（更生霉素）（更生霉素）作用机理：作用机理：一、影响细菌细胞膜功能（多粘菌素，短杆菌素一、影响细菌细胞膜功能（多粘菌素，短杆菌素,抗感染抗感染）二、破坏二、破坏DNADNA和肽多糖的合成（博来霉素，万古霉素）和肽多糖的合成（博来霉素，万古霉素）三、抑制三、抑制RNARNA合成（放线菌素）合成（放线菌素）鉴别：鉴别：茚三酮反应：茚

46、三酮反应：磷钨酸磷钨酸反应：反应：（沉淀反应）（沉淀反应）双缩脲反应：双缩脲反应：第三节第三节 抗生素类药物的杂质检查抗生素类药物的杂质检查一、高分子杂质、降解产物及异构体一、高分子杂质、降解产物及异构体 1、青霉素、青霉素 过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白(青霉噻唑基团青霉噻唑基团)凝胶过滤法分离，用凝胶过滤法分离，用Penamaldate法测定法测定 HgCl2 青霉噻唑衍生物青霉噻唑衍生物 Penamaldate衍生物（衍生物（285nm）P1872、链霉素、链霉素毒性杂质毒性杂质:链霉胍链霉胍,链胍双氢链糖链胍双氢链糖;双氢链霉素双氢链霉素;链霉素醛

47、基化链霉素醛基化合物合物;神经毒性：二链霉胺神经毒性：二链霉胺二链霉胺含量测定原理二链霉胺含量测定原理:二链霉胺等不被二链霉胺等不被KBH4还原，能与盐酸还原，能与盐酸氨基脲氨基脲反应，反应，生成的缩氨脲在生成的缩氨脲在233nm有吸收峰有吸收峰n在在2010版中国药典版中国药典n控制控制5个阿奇霉素相关物个阿奇霉素相关物：n 红霉素红霉素A偕亚胺醚偕亚胺醚n 3-N-去甲基阿奇霉素去甲基阿奇霉素n 3-O-去克拉定糖阿奇霉素去克拉定糖阿奇霉素n 阿奇霉素杂质阿奇霉素杂质Gxn 阿奇霉素阿奇霉素Bn欧洲药典和美国药典标准中列出了欧洲药典和美国药典标准中列出了16种和种和13种相种相关物相比较关

48、物相比较3 阿奇霉素有关物质的检查阿奇霉素有关物质的检查在 中国药典(2015年版)的阿奇霉素条目中,采用高效液相色谱配合紫外检测器法检测药物,并要求控制8个阿奇霉素相关物:杂 质 A(氮 红 霉 素)、杂 质 B(阿 奇 霉 素 B)、杂 质 H(3-N-4-乙 酰氨基苯基磺酸基-3-N-去甲基阿奇霉素、杂质 I(3-N-去甲基阿奇霉 素)、杂质 J(阿奇霉素 J)、杂质 Q(红霉素 A-6,9-亚胺醚)、杂质 R(红霉素 A 9,11-亚胺醚)、杂质 S(红霉素 A-E-肟)。n照含量测定项下的色谱条件照含量测定项下的色谱条件n液相色谱仪液相色谱仪n阿奇霉素阿奇霉素B峰面积不得大于对照溶液

49、主峰面积峰面积不得大于对照溶液主峰面积1.0%n阿奇霉素阿奇霉素Gx与红霉素与红霉素A偕亚胺醚偕亚胺醚按校正后的峰面按校正后的峰面积计算不得大于对照溶液主峰面积的积计算不得大于对照溶液主峰面积的0.5%，n其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的的0.5%n各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.0%阿奇霉素有关物质的检查阿奇霉素有关物质的检查4、土霉素、土霉素 脱水土霉素、差向土霉素、脱水土霉素、差向土霉素、-阿扑土阿扑土霉素、霉素、-阿扑土霉素等降解产物阿扑土霉素等降解产物 薄层分离，荧光测定薄层

50、分离，荧光测定5、四环素、四环素 脱水四环素、差向四环素、差向脱水脱水四环素、差向四环素、差向脱水四环素四环素 HPLC测定测定二、无机杂质的检查二、无机杂质的检查三、溶媒残留量三、溶媒残留量 1、比色法、比色法：甲醇氧化成甲醛，用品红试剂测定甲醇氧化成甲醛，用品红试剂测定 丙酮与水杨醛缩合比色丙酮与水杨醛缩合比色 醋酸丁酯与盐酸羟胺反应后比色测定醋酸丁酯与盐酸羟胺反应后比色测定 2、气相色谱、气相色谱 3、HPLC 4、红外光谱、红外光谱第四节第四节 抗生素类药物含量的测定法抗生素类药物含量的测定法n一、容量法一、容量法 二、光谱学测定法二、光谱学测定法n三、色谱法测定法三、色谱法测定法第四