鸡胚接种技术分析 PPT课件.ppt

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1、第二章第二章 鸡胚接种技术鸡胚接种技术一、概况一、概况n n19111911年年RousRous和和MurphyMurphy首先应用鸡胚培养首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒研究肉瘤病毒(RousRous肉瘤肉瘤)的繁殖。的繁殖。n n19381938年年GoodpastureGoodpasture和和BurnetBurnet等应用鸡胚等应用鸡胚繁殖病毒、繁殖病毒、CoxCox应用卵黄囊培养立克次体。应用卵黄囊培养立克次体。鸡胚培养法的鸡胚培养法的优点优点：n n鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液

2、体含大量病毒。液体含大量病毒。n n鸡胚是一整体，有神经血管的分布及脏鸡胚是一整体，有神经血管的分布及脏器的构造。器的构造。n n来源充足，操作简单，通常是无菌的，来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。对接种的病毒不产生抗体。鸡胚培养法的鸡胚培养法的缺点缺点：n n一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。n n卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。卵黄中常常含有抗家

3、禽病原体的母体抗体。n n某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递到鸡胚。到鸡胚。到鸡胚。到鸡胚。n n通常鸡胚含有白血病病毒。通常鸡胚含有白血病病毒。通常鸡胚含有白血病病毒。通常鸡胚含有白血病病毒。n n在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。鸡胚就

4、会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。第一节第一节 鸡胚的结构与生理鸡胚的结构与生理 鸡胚是由三个胚层发育起来的，鸡胚是由三个胚层发育起来的，即即外胚层、中胚层和内胚层外胚层、中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。它们构成胚胎的组织与器官。（约（约10日龄鸡胚的结构见图）日龄鸡胚的结构见图）卵壳与壳膜卵壳与壳膜卵壳位于最外层的坚硬壳层；卵壳位于最外层的坚硬壳层；壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。气室气室功能主要是呼吸和调节压力。功能主

5、要是呼吸和调节压力。绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。羊膜羊膜胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。尿囊腔尿囊腔位于绒毛尿囊腔和羊膜之间位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器，胚胎排泄器官含官含5 520ml20ml尿囊液，含大量的尿酸盐，尿囊液，含大量的尿酸盐，为减少沉淀，盐水稀释再为减少沉淀，盐水稀释再44保存。保存。卵黄囊卵黄囊主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。卵白卵白外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。第二节第二节 鸡胚的

6、孵育和检查鸡胚的孵育和检查n n受精鸡卵的供给 没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病 毒、布氏杆菌等；毒、布氏杆菌等；培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗 生素的鸡群。生素的鸡群。n n鸡胚的孵育鸡胚的孵育 温度为温度为38383939；湿度为湿度为4040-70-70；翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空 气流通；气流通；通风：排出通风：排出COCO2 2和吸入和吸入O O2 2。n n 检卵检卵 血管血管血管血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血活胚可见清晰的血管，有时可见血 管搏动，

7、死胚血管模糊成淤血带或淤血块。管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。胎动胎动胎动胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在活胚可见明显的自然运动，尤其在 转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎 发红像出血样，有的呈现黑块。发红像出血样，有的呈现黑块。绒毛尿囊膜发育界限绒毛尿囊膜发育界限绒毛尿囊膜发育界限绒毛尿囊膜发育界限：发育好的鸡胚可见发育好的鸡胚可见 密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一现象。死胚则见不到这一现象。第三节第三节 鸡胚接种途径及方法鸡胚接种途径及方法（一）羊膜腔接种（一）羊膜腔接种 应用于从应用于

8、从应用于从应用于从临床材料中分离流感病毒临床材料中分离流感病毒临床材料中分离流感病毒临床材料中分离流感病毒等，病等，病等，病等，病毒感染后可收集毒感染后可收集毒感染后可收集毒感染后可收集羊水和尿囊液羊水和尿囊液羊水和尿囊液羊水和尿囊液。接种步骤与方法接种步骤与方法n n将将将将10121012日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。n n消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻

9、出一约消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm6mm10mm6mm10mm6mm10mm6mm的长方形的长方形的长方形的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。裂痕，注意勿钻破壳膜。裂痕，注意勿钻破壳膜。裂痕，注意勿钻破壳膜。n n再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，

10、以便膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。观察胚胎的位置。观察胚胎的位置。观察胚胎的位置。n n将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1O.1O.1O.10.2ml0.2ml0.2ml0

11、.2ml病毒液。病毒液。病毒液。病毒液。n n拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于的窗口封住，于的窗口封住，于的窗口封住，于3333333335353535孵育孵育孵育孵育4848484872h72h72h72h，要保持鸡胚钝端朝上。，要保持鸡胚钝端朝上。，要保持鸡胚钝端朝上。，要保持鸡胚钝端朝上。羊膜腔接种法羊膜腔接种法 解剖与收获解剖与收获n n收获前鸡胚须置收获前鸡胚须置收获前鸡胚须置收获前鸡胚须

12、置4444冰箱冰箱冰箱冰箱6h6h6h6h或过夜或过夜或过夜或过夜，但不能放置时间，但不能放置时间，但不能放置时间，但不能放置时间过长过长过长过长(过长会引起散黄过长会引起散黄过长会引起散黄过长会引起散黄)。如急于收获亦可置。如急于收获亦可置。如急于收获亦可置。如急于收获亦可置-20-20-20-20冰冰冰冰箱箱箱箱lhlhlhlh左右。左右。左右。左右。n n预冷的目的是，将预冷的目的是，将预冷的目的是，将预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病时流出

13、红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。毒滴度下降。毒滴度下降。毒滴度下降。n n病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。（二）绒毛尿囊膜接种n n常用于常用于

14、常用于常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。n n另外，另外，另外，另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，因，因，因，因为感染性病毒颗粒的数目

15、可以通过产生的斑为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。该方法还可用于和痘的数目来计算。该方法还可用于和痘的数目来计算。该方法还可用于和痘的数目来计算。该方法还可用于抗病毒抗病毒抗病毒抗病毒血清的滴定试验血清的滴定试验血清的滴定试验血清的滴定试验，即在有抗体存在的情况下，即在有抗体存在的情况下，即在有抗体存在的情况下，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。痘疱形成受到抑制。痘疱形成受到抑制。痘疱形成受到抑制。n n将孵育将孵育l013l013日龄的鸡胚标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳日龄的鸡胚

16、标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳上划一等边三角形。上划一等边三角形。n n消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。n n轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。n n用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再

17、用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。膜下陷而形成人工气室。n n在卵壳的窗口滴在卵壳的窗口滴0.050.1ml0.050.1ml病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。n n在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在上的位置，在上的位置，33353335继续培养继续培养484872h72h。接

18、种步骤与方法接种步骤与方法绒毛尿囊膜接种法绒毛尿囊膜接种法解剖与收获解剖与收获 用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用灶形状或用于传代，或用5050甘油保存。甘油保存。同时作无菌培养。同时作无菌培养。（三）尿囊腔接种n n广广泛泛应应用用于于流流感感病病毒毒、流流行行性性腮腮腺腺炎炎病病毒毒和和新新城城疫疫病病毒毒的的适适应应和和传传代代培培养养，这这些些病病毒毒被被接接种种到到尿尿囊囊腔腔后后，可可在在内内皮皮细细胞胞中中复复制制，复复制制的的病病毒毒被被释释放放到到尿尿囊

19、囊液液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。n n取取911911日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面胚胎面与气室交界之边缘上约与气室交界之边缘上约1mm1mm处避开血管作一标记处避开血管作一标记，此即为，此即为注射点。注射点。n n将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用开孔器钻开一长约开孔器钻开一长约2mm2mm小口。小口。n n再次消毒钻孔区，再次消毒钻孔区，接种病毒液接种病毒液0.10.10.2ml0.2ml，将针头刺入，将针头刺入孔内，经尿囊膜入尿囊腔，

20、注入病毒液。孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。n n消毒后用石蜡溶化封孔，于消毒后用石蜡溶化封孔，于33333535孵卵器孵育孵卵器孵育484872h72h，；于接种后，；于接种后24h24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。内死亡者为非特异性死胚应弃去。接种步骤与方法接种步骤与方法尿囊腔接种法尿囊腔接种法解剖与收获解剖与收获n n接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，甲型流感病甲型流感病甲型流感病甲型流感病毒一般培养毒一般培养毒一般培养毒一般培养4444444448h48h48h48h，乙型流感病毒培养，乙型流感病毒培养，乙型流感病毒培养，乙型流感病毒培养

21、72h72h72h72h。n n收获前鸡胚置收获前鸡胚置44冰箱冰箱6h6h或过夜，但不能放置时间过长。或过夜，但不能放置时间过长。n n消毒气室的卵壳，用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳，用无消毒气室的卵壳，用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳，用无菌镊子撕去气室部壳膜，并翻开到卵壳边上。菌镊子撕去气室部壳膜，并翻开到卵壳边上。n n将鸡卵倾向胚胎一侧，用灭菌毛细吸管通过绒毛尿囊膜将鸡卵倾向胚胎一侧，用灭菌毛细吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸出尿囊液。进入尿囊腔，吸出尿囊液。一般一般一般一般一个鸡胚可收获一个鸡胚可收获一个鸡胚可收获一个鸡胚可收获5 5 5 510ml10ml10ml10ml的尿囊液的尿囊液的

22、尿囊液的尿囊液。n n若若操作时损伤了血管操作时损伤了血管，则，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊病毒会吸附在红细胞上，尿囊病毒会吸附在红细胞上，尿囊病毒会吸附在红细胞上，尿囊液则无。液则无。液则无。液则无。经无菌试验后，可在经无菌试验后，可在44或低温保存。或低温保存。（四）卵黄囊接种n n主主要要用用于于虫虫媒媒病病毒毒、衣衣原原体体及及立立克克次次体体等等的的分分离离和和繁繁殖殖。这这些些大大的的病病原原体体主主要要在在卵卵黄黄囊囊的的内内皮皮细细胞胞生生长长，且且生生长长速速度度很快，立克次体染色后也可看到。很快，立克次体染色后也可看到。n n取取5 58 8日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂

23、直放置在卵日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，钝端朝上，消毒气室端。架上，钝端朝上，消毒气室端。n n用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有6 6号针头号针头的的1m11m1注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约3cm3cm，注入，注入0.20.20.5ml0.5ml待接种的病毒于卵黄囊内，随后用胶待接种的病毒于卵黄囊内，随后用胶带或溶化的石蜡封孔。带或溶化的石蜡封孔。n n置孵化箱内继续孵育置孵化箱内继续孵育3 38d8d，时间长短应根据病毒或立克，时间长短应根据病毒或立克次体的种类而定，每天

24、翻卵次体的种类而定，每天翻卵2 2次，弃掉次，弃掉24h24h内死亡的鸡胚内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后但东方型和西方型马脑炎可能在接种后151524h24h内死亡内死亡)。接种步骤与方法接种步骤与方法卵黄囊接种法卵黄囊接种法解剖与收获解剖与收获n n收获时，鸡卵预冷，消毒气室端的卵壳，剪掉收获时，鸡卵预冷，消毒气室端的卵壳，剪掉卵壳，除去壳膜后，用镊子将卵黄囊与绒毛尿卵壳，除去壳膜后，用镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开。囊膜分开。n n夹出卵黄囊放在灭菌平皿中，必要时用生理盐夹出卵黄囊放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入平皿中，水冲去卵黄。也可将全部内

25、容物倾入平皿中，然后剥出卵黄囊。然后剥出卵黄囊。n n将不带卵黄的膜放在无菌平皿或烧杯中，以便将不带卵黄的膜放在无菌平皿或烧杯中，以便用于染色检查或进行传代。对某些病毒的分离用于染色检查或进行传代。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。则要收集全部胚体。三、注意事项三、注意事项n n防止污染：防止污染：鸡胚为一活的有机体，因此 要严格无菌操作。n n动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。n n适宜的培养温度：第四节第四节 病毒的检测病毒的检测n n无菌试验无菌试验 目的目的目的目的:证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染。证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染。证实收集的鸡胚是否受到细

26、菌的污染。证实收集的鸡胚是否受到细菌的污染。方法方法方法方法:pp 收集鸡胚组织接种肉汤培养；收集鸡胚组织接种肉汤培养；收集鸡胚组织接种肉汤培养；收集鸡胚组织接种肉汤培养；pp 37 37 37 37培养培养培养培养36h36h36h36h；pp 肉汤清亮则无污染肉汤清亮则无污染肉汤清亮则无污染肉汤清亮则无污染,肉汤浑浊或有菌落肉汤浑浊或有菌落肉汤浑浊或有菌落肉汤浑浊或有菌落,说明鸡说明鸡说明鸡说明鸡 胚被细菌污染。胚被细菌污染。胚被细菌污染。胚被细菌污染。n直接观察法直接观察法 在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹:如痘类病

27、毒和如痘类病毒和如痘类病毒和如痘类病毒和 疱疹病毒疱疹病毒疱疹病毒疱疹病毒,常产生白色或灰色痘疱常产生白色或灰色痘疱常产生白色或灰色痘疱常产生白色或灰色痘疱,并有充血；并有充血；并有充血；并有充血；引起鸡胚死亡引起鸡胚死亡引起鸡胚死亡引起鸡胚死亡:如新城疫病毒、乙脑病毒；如新城疫病毒、乙脑病毒；如新城疫病毒、乙脑病毒；如新城疫病毒、乙脑病毒；造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓：马流感病毒。：马流感病毒。：马流感病毒。：马流感病毒。n实验检测法实验检测法实验检测法实验检测法 血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；血凝试验和血

28、凝抑制试验：流感病毒的存在；血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；补体结合试验：腮腺炎病毒；补体结合试验：腮腺炎病毒；补体结合试验：腮腺炎病毒；补体结合试验：腮腺炎病毒；其他方法：其他方法：其他方法：其他方法：PCRPCRPCRPCR等。等。等。等。检测方法检测方法第五节第五节 鸡胚接种技术的应用鸡胚接种技术的应用uu病毒的培养、分离与鉴定病毒的培养、分离与鉴定流感病毒的分离和鉴定流感病毒的分离和鉴定流感病毒的分离和鉴定流感病毒的分离和鉴定禽流感病毒的分离和鉴定禽流感病毒的分离和鉴定禽流感病毒的分离和鉴定禽流感病毒的分离和鉴定其他病毒的分离和鉴定其他病

29、毒的分离和鉴定其他病毒的分离和鉴定其他病毒的分离和鉴定uu疫苗的研制疫苗的研制活疫苗和死疫苗活疫苗和死疫苗活疫苗和死疫苗活疫苗和死疫苗第三章 动物试验技术 实验动物实验动物(experimental animals)(experimental animals)：是：是指经人工饲养，遗传背景明确、来源清指经人工饲养，遗传背景明确、来源清楚，控制其携带的微生物，用于科学研楚，控制其携带的微生物，用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其它科学实究、教学、生产、鉴定以及其它科学实验的所有动物。验的所有动物。第一节 实验动物的种类和基本 操作方法一、实验动物的种类一、实验动物的种类（微生物控制分类）（微生物

30、控制分类）uu普通动物普通动物普通动物普通动物(conventional animals(conventional animals(conventional animals(conventional animals，CV)CV)CV)CV)：称一级动物，是微生称一级动物，是微生物控制要求最低级别的实验动物，要求不携带动物烈性传染病物控制要求最低级别的实验动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原。一般仅供教学示范及作为预备试验之用。和人兽共患病病原。一般仅供教学示范及作为预备试验之用。uu清洁动物清洁动物清洁动物清洁动物(clean animals(clean animals(clean

31、animals(clean animals，CL)CL)CL)CL)：称二级动物，除不携带普通动称二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原物病原体外，要求不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体。体。uu无特定病原体动物无特定病原体动物无特定病原体动物无特定病原体动物(specific pathogen free animals(specific pathogen free animals(specific pathogen free animals(specific pathogen free animals，SPF)SPF)SPF)SPF)：又称三级动

32、物，除普通动物、清洁动物不得携带的病原外，还又称三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的病原外，还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染。要求排除潜在感染或条件致病菌的感染。是是是是目前国际公认的标目前国际公认的标目前国际公认的标目前国际公认的标准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。uu无菌动物无菌动物无菌动物无菌动物(germfree animals(germfree animals(germfree animals(germfree animals，GF)GF)GF)GF)

33、和悉生动物和悉生动物和悉生动物和悉生动物(gnotobioticgnotobioticgnotobioticgnotobiotic animalsanimalsanimalsanimals，GN)GN)GN)GN)：为四级动物。无菌动物要求在体内外不得检出为四级动物。无菌动物要求在体内外不得检出其他的生命体。悉生动物又称已知菌动物，是将已知菌植入无其他的生命体。悉生动物又称已知菌动物，是将已知菌植入无菌动物体内。菌动物体内。实验动物的遗传学控制分类实验动物的遗传学控制分类 uu近交系近交系近交系近交系(inbred strain)(inbred strain)(inbred strain)(i

34、nbred strain)：是指经过连续是指经过连续2020代以上全代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系。特点有同胞或亲子交配培育的动物品系。特点有:基因型相基因型相同，表现型一致；对外来刺激反应一致；实验结果重同，表现型一致；对外来刺激反应一致；实验结果重复性好，可比性强。复性好，可比性强。uu封闭群封闭群封闭群封闭群(closed colony)(closed colony)(closed colony)(closed colony)：是指一个不从外界引入新是指一个不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式繁殖一定代次的实验动物群的血缘，非近亲交配方式繁殖一定代次的实验动物群体。特点是群体遗传特

35、异性相对稳定，个体间具有杂体。特点是群体遗传特异性相对稳定，个体间具有杂合性，存在一定差异。合性，存在一定差异。uu突变系突变系突变系突变系(mutant strain)(mutant strain)(mutant strain)(mutant strain)：是指由于遗传基因发生突是指由于遗传基因发生突变而具有某些特殊性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿变而具有某些特殊性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿病小鼠等。病小鼠等。实验动物的遗传学控制分类实验动物的遗传学控制分类 uu杂交群动物杂交群动物杂交群动物杂交群动物(hybrid animal)(hybrid animal)(hybrid animal

36、)(hybrid animal)：又称异系杂交，是由又称异系杂交，是由不同的品系杂交所产生的后代。由两个近交系之间交不同的品系杂交所产生的后代。由两个近交系之间交配产生的动物称为配产生的动物称为杂交一代杂交一代，其遗传和表型均一性好，其遗传和表型均一性好，生命力、适应力和抗病力较近交系动物强，实验结果生命力、适应力和抗病力较近交系动物强，实验结果重复性好，适应实验范围更大。重复性好，适应实验范围更大。uu转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物(transgenic animals)(transgenic animals)(transgenic animals)(transgenic anim

37、als)与基因缺陷动物：与基因缺陷动物：与基因缺陷动物：与基因缺陷动物：将外源性基因插入生殖细胞基因组并能正常繁衍的动将外源性基因插入生殖细胞基因组并能正常繁衍的动物称为转基因动物。另外，还可以采用基因剔除技术物称为转基因动物。另外，还可以采用基因剔除技术构建基因缺陷动物，通过删减单一基因或相关基因组，构建基因缺陷动物，通过删减单一基因或相关基因组，研究基因的功能。研究基因的功能。二、常用的实验动物二、常用的实验动物uu小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、SCID小鼠；uu豚鼠：制备抗体和补体以及提供红细胞。uu家兔：三、实验动物常用基本操作技术三、实验动物常用基本操作技术uu实验动物的捕

38、捉和固定：uu实验动物编号和分组：uu实验动物的麻醉方法：乙醚吸入法是最 常用的方法。皮下接种：皮下接种：皮下接种：皮下接种：多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。腹腔接种腹腔接种腹腔接种腹腔接种：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药途径。及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药途径。及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药

39、途径。及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药途径。静脉接种静脉接种静脉接种静脉接种：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用外耳缘脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用外耳缘脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用外耳缘脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用

40、外耳缘静脉注射。静脉注射。静脉注射。静脉注射。uu接种途径和接种方法接种途径和接种方法 消化道接种消化道接种消化道接种消化道接种：用于分离腹泻病毒或由消化道感染病：用于分离腹泻病毒或由消化道感染病：用于分离腹泻病毒或由消化道感染病：用于分离腹泻病毒或由消化道感染病 毒研究。毒研究。毒研究。毒研究。鼻腔接种法鼻腔接种法鼻腔接种法鼻腔接种法：将接种物滴入动物鼻腔，接种量小鼠：将接种物滴入动物鼻腔，接种量小鼠：将接种物滴入动物鼻腔，接种量小鼠：将接种物滴入动物鼻腔，接种量小鼠 0.03 0.03 0.03 0.030.05ml0.05ml0.05ml0.05ml，大鼠，大鼠，大鼠，大鼠0.050.0

41、50.050.05O.1mlO.1mlO.1mlO.1ml。颅内接种法颅内接种法颅内接种法颅内接种法：将临床标本或特定的病毒直接接种于：将临床标本或特定的病毒直接接种于：将临床标本或特定的病毒直接接种于：将临床标本或特定的病毒直接接种于 动物脑内，使动物形成实验性中枢神动物脑内，使动物形成实验性中枢神动物脑内，使动物形成实验性中枢神动物脑内，使动物形成实验性中枢神 经系统感染。经系统感染。经系统感染。经系统感染。角膜接种法角膜接种法角膜接种法角膜接种法:细针尖轻划角膜，划痕与眼裂平行，约细针尖轻划角膜，划痕与眼裂平行，约细针尖轻划角膜，划痕与眼裂平行，约细针尖轻划角膜，划痕与眼裂平行，约 三道

42、。接种液滴加三道。接种液滴加三道。接种液滴加三道。接种液滴加2 2 2 23 3 3 3滴，接种后滴，接种后滴，接种后滴，接种后48484848 72h 72h 72h 72h观察结果。观察结果。观察结果。观察结果。u实验标本的采集实验标本的采集p采血方法采血方法p脑脊液的采集脑脊液的采集p尿液的采集尿液的采集p腹水的采集腹水的采集四、使用实验动物的基本原则四、使用实验动物的基本原则pp研究目的明确研究目的明确：探讨疾病的发病机制和复制动物模型；探讨疾病的发病机制和复制动物模型；制备诊断抗原、抗体及疫苗；制备诊断抗原、抗体及疫苗；监测诊断抗原、抗体及疫苗的安全性、有效性。监测诊断抗原、抗体及疫

43、苗的安全性、有效性。pp动物选择原则：动物选择原则：使用顺序：小鼠、大鼠、兔、犬、猴、人。使用顺序：小鼠、大鼠、兔、犬、猴、人。pp使用实验动物的使用实验动物的3Rs3Rs原则：原则：r replace(eplace(替代）、替代）、r reduction(eduction(减少）、减少）、r refinement(efinement(优化）的原优化）的原则。则。第二节第二节 动物实验在病毒检验中的应用动物实验在病毒检验中的应用pp动物实验在病毒分离中的应用动物实验在病毒分离中的应用 确定疾病的病因；确定疾病的病因；使病毒增殖，提高临床检出率；使病毒增殖，提高临床检出率；制备高滴度的病毒诊断抗

44、原；制备高滴度的病毒诊断抗原；制备大量的抗病毒血清。制备大量的抗病毒血清。pp动物实验在病毒鉴定中的应用动物实验在病毒鉴定中的应用 病毒的宿主范围；病毒的宿主范围；病毒对组织的亲嗜性；病毒对组织的亲嗜性；病毒的感染性和侵袭强度；病毒的感染性和侵袭强度；病毒可能的传播途径，以及与临床病毒可能的传播途径，以及与临床 相关的体征和症状；相关的体征和症状；病毒诱导宿主的免疫反应特征。病毒诱导宿主的免疫反应特征。pp动物实验在病毒性疾病研究中的应用动物实验在病毒性疾病研究中的应用 病毒与宿主之间相互作用的机制；病毒与宿主之间相互作用的机制；病毒与宿主之间相互作用的机制；病毒与宿主之间相互作用的机制；病毒

45、慢性感染和潜伏感染机制；病毒慢性感染和潜伏感染机制；病毒慢性感染和潜伏感染机制；病毒慢性感染和潜伏感染机制；病毒感染的免疫逃逸和免疫耐受机制；病毒感染的免疫逃逸和免疫耐受机制；病毒感染的免疫逃逸和免疫耐受机制；病毒感染的免疫逃逸和免疫耐受机制；病毒诱发肿瘤的机制；病毒诱发肿瘤的机制；病毒诱发肿瘤的机制；病毒诱发肿瘤的机制；病毒特殊基因或蛋白在病毒感染中的作用。病毒特殊基因或蛋白在病毒感染中的作用。病毒特殊基因或蛋白在病毒感染中的作用。病毒特殊基因或蛋白在病毒感染中的作用。pp动物实验在抗病毒药物和疫苗效果及安动物实验在抗病毒药物和疫苗效果及安全性检测中的应用全性检测中的应用 评价抗病毒药物的疗

46、效和安全性；评价抗病毒药物的疗效和安全性；评价免疫血清的安全性和效果；评价免疫血清的安全性和效果；评价疫苗的安全性和效果；评价疫苗的安全性和效果；评价佐剂的安全性和效果。评价佐剂的安全性和效果。第三节第三节 病毒学检验中动物实病毒学检验中动物实 验的基本步骤验的基本步骤p临床标本的制备和处理；p敏感动物的选择、标记并分组；p接种途径的选择；p观察病毒感染动物的异常生理变化；p动物标本的采集、处理和检查；p实验数据的统计和分析。第四节第四节 病毒学动物实验应病毒学动物实验应 注意的问题注意的问题uu安全问题：uu实验动物自发性病毒感染对实验结果的影响。小小 结结u鸡胚接种的优缺点；u四种常见的鸡胚接种途径及注意事项；u鸡胚接种后病毒的检测；u鸡胚接种技术的应用；u动物实验在病毒检验中的应用及注意的问题。THE END