《生药学》理化鉴定 PPT课件.ppt

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1、理化鉴定 理化鉴定(physical and chemicalidentification)利用某些物理的、化学的或仪器分析方法，对生药中所含有效成分或主要成分或特征性成分进行定性和定量分析，以鉴定其真伪和品质优良度的一种方法。理化鉴定中药理化鉴定发展很快，新的分析手段和方法不断出现。可确定中药的真伪优劣；开发利用新资源；指导中药材的栽培加工，扩大药用部分；制订中药质量标准。发展方向：从宏观和微观的形态学鉴定向有效成分和药效鉴定方向发展。常用的理化鉴定方法 化学定性反应 微量升华荧光分析色谱法纸色谱与薄层色谱(PC&TLC)气相色谱（GC)高效液相色谱(HPLC)电泳法光谱法定义定义方法方法直

2、接将生药切片或粉末置载直接将生药切片或粉末置载玻片上，滴加试液，加盖玻玻片上，滴加试液，加盖玻片在显微镜下观察产生的结片在显微镜下观察产生的结晶、沉淀或颜色。晶、沉淀或颜色。生药的提取物置载玻片上，生药的提取物置载玻片上，滴加试液，加盖玻片在显微滴加试液，加盖玻片在显微镜下观察反应。镜下观察反应。显微化学定位显微化学定位一、一、化学定性反应化学定性反应1.1.显微化学反应显微化学反应2.沉淀反应：利用生药某些化学成分能与某些试剂产生特殊的沉淀反应来鉴别。3.泡沫反应和溶血指数的测定二、微量升华二、微量升华 利用中药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其结晶

3、形状、颜色及化学反应作为鉴别特征。一、微量升华的原理及方法一、微量升华的原理及方法二、在鉴定中的应用二、在鉴定中的应用三、荧光分析三、荧光分析利用生药中所含的某些化学成分，在紫外光或自然光下能产生一定颜色的荧光性质进行鉴别。例如黄连饮片显黄色荧光；浙贝母粉末显亮淡绿色荧光；大黄粉末显深棕色荧光。荧光效率主要与物质的结构有关，具有-共轭结构的物质才能产生较强的荧光，共轭结构加长，荧光增强。含有黄酮、恩醌、香豆素、木脂素成分的生药，一般具有较强的荧光反应。荧光分析法在生药鉴定中的应用荧光分析法在生药鉴定中的应用定性分析定性分析紫外分析仪法紫外分析仪法1、观察生药整体、观察生药整体2、观察生药的新鲜

4、断面或饮片、观察生药的新鲜断面或饮片3、观察生药粉末、观察生药粉末4、直接观察生药的某种溶剂浸、直接观察生药的某种溶剂浸 出液出液5、将生药提取液滴于滤纸上，、将生药提取液滴于滤纸上，挥干溶剂观察挥干溶剂观察6、生药提取液与化学试剂作用、生药提取液与化学试剂作用 后产生荧光后产生荧光 7、多重观察、多重观察 日光法日光法荧光显微镜法荧光显微镜法荧光光谱法荧光光谱法定量分析：荧光分光光度法、薄层荧光扫描法定量分析：荧光分光光度法、薄层荧光扫描法四、色谱法四、色谱法常用以下三种色谱法：薄层色谱法(TLC)气相色谱法(GC)高效液相色谱法(HPLC)薄层色谱薄层色谱操作：选择吸附剂操作：选择吸附剂

5、制备薄层板制备薄层板 点样点样 定性参数的选测定定性参数的选测定 显色显色 展开展开 （比移值（比移值Rf、相对比移值、相对比移值Rst）应用：定性分析应用：定性分析 定量分析定量分析 以以RfRf做定性的依据，因影响做定性的依据，因影响RfRf因素多，需用标准因素多，需用标准 对照品作对照。在两种或两种以上展开系统种展开，对照品作对照。在两种或两种以上展开系统种展开，若样品中斑点的若样品中斑点的RfRf值与标准对照品的值与标准对照品的RfRf值匀相同可基值匀相同可基 本肯定二者为同一化合物。本肯定二者为同一化合物。定性鉴别定性鉴别用标准物用标准物质对照别质对照别标准标准对照品对照品对照药材对

6、照药材用相对比用相对比移值鉴别移值鉴别用文字描用文字描述鉴别述鉴别 原点中心至斑点中心的距离原点中心至斑点中心的距离Rst=原点中心至参考物质斑点中心的距离原点中心至参考物质斑点中心的距离定量鉴别定量鉴别n分两类：n一是将待测物从薄层板洗拖后，选择适宜的方法测定（洗脱法）；n二是薄层展开后，用薄层扫描仪在薄层板上测定被分离组分的含量（薄层扫描法）。n洗脱法分四步进行：n待测组分的分离n斑点定位n斑点的收集及洗脱n测定（多采用UV及可见光分光度法）薄层扫描法：薄层扫描法：波长的选择（样品波长、参比波长）波长的选择（样品波长、参比波长）测定方式的确立（透射、反射、荧光）测定方式的确立（透射、反射、

7、荧光）扫描方式（直线式、锯齿式）扫描方式（直线式、锯齿式）标准曲线线性化（与散射参数有关，硅胶薄标准曲线线性化（与散射参数有关，硅胶薄层板层板SX=3SX=3，氧化铝薄层板，氧化铝薄层板SX=7SX=7）定量前需考察的主要内容：工作曲线、精密定量前需考察的主要内容：工作曲线、精密度、准确度度、准确度测定方法：外标一点法，外标二点法。测定方法：外标一点法，外标二点法。HPLCHPLC 可用于定性和定量，色谱图中各色谱峰可用于定性和定量，色谱图中各色谱峰的保留时间、色谱峰相对百分峰面积及的保留时间、色谱峰相对百分峰面积及主要色谱峰的主要色谱峰的UVUV吸收光谱，均可作为生吸收光谱，均可作为生药真实

8、性鉴定的指纹资料。药真实性鉴定的指纹资料。是生药及制是生药及制剂质量分析常用的方法。剂质量分析常用的方法。GC主要用于含挥发性成分的定性和定量。用于主要用于含挥发性成分的定性和定量。用于鉴定的数据主要是保留时间、相对百分峰面鉴定的数据主要是保留时间、相对百分峰面积。常常和质谱联用，快速鉴定成分积。常常和质谱联用，快速鉴定成分五、电泳法带电质点（分子、离子或胶体颗粒）在电场作带电质点（分子、离子或胶体颗粒）在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极移动，称用下，向着与其所带电荷相反的电极移动，称为电泳。为电泳。应用：应用：生物学和生物化学领域。生物学和生物化学领域。生药中主要用于氨基酸、多肽、蛋白

9、质、生药中主要用于氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等。核酸等。分光光度法 紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光谱法原子吸收分光光度法 六、光谱法六、光谱法 一切物质都会对可见光及不可见光中的某些波长的一切物质都会对可见光及不可见光中的某些波长的光线产生吸收。不过其吸收的程度是不同的。即物质对不光线产生吸收。不过其吸收的程度是不同的。即物质对不同波长的光线表现出不同的吸收能力，物质的这一特性称同波长的光线表现出不同的吸收能力，物质的这一特性称为选择吸收。为选择吸收。物质对光线的选择吸收反映了它们分子内部结构的差物质对光线的选择吸收反映了它们分子内部结构的差异。也就是说，通过研究物质得分子吸收光谱，就

10、可以鉴异。也就是说，通过研究物质得分子吸收光谱，就可以鉴别物质的分子结构。这是分光光度法对生药进行定性鉴别别物质的分子结构。这是分光光度法对生药进行定性鉴别的依据。的依据。物质吸收光子能量的强度，不仅取决于物质的分子结物质吸收光子能量的强度，不仅取决于物质的分子结构，而且还与被光子所作用的物质的分子数目，即物质的构，而且还与被光子所作用的物质的分子数目，即物质的浓度有关。这是分光光度法对生药进行定量鉴别的依据。浓度有关。这是分光光度法对生药进行定量鉴别的依据。分光光度法在生药定性分析中的应用分光光度法在生药定性分析中的应用原理：同种生药的光谱具有一定的稳定性及重现性原理：同种生药的光谱具有一定

11、的稳定性及重现性 不同种类生药的光谱各不相同不同种类生药的光谱各不相同方法：方法：UVUV分光光度法分光光度法比较光谱的一致性（与对照药材比较；比较光谱的一致性（与对照药材比较；与文献标准光谱核对）与文献标准光谱核对）比较导数光谱的一致性（用于比较导数光谱的一致性（用于UVUV光谱光谱 不易区分）不易区分）比较光谱的特征吸收（常用特征数据：比较光谱的特征吸收（常用特征数据：最大吸收波长和吸光度比值）最大吸收波长和吸光度比值）电子光谱，辐射波长电子光谱，辐射波长200-400200-400nmnm，仪器为，仪器为UVUV分光光度计选分光光度计选择性不如择性不如 IRIR。主要用于定量及。主要用于

12、定量及物理常数测定物理常数测定 IRIR分光光度法分光光度法 振转光谱，辐射波长振转光谱，辐射波长2.5-15m2.5-15m。具特征峰多、专属性强。具特征峰多、专属性强（特别是在（特别是在 7-15m7-15m一段称指纹图谱，峰多且尖锐）、用试样量少一段称指纹图谱，峰多且尖锐）、用试样量少快速简便。用于生药真伪鉴别及结构鉴定。快速简便。用于生药真伪鉴别及结构鉴定。方法：方法：1 1、样品的处理：直接粉末法、溶剂提取法、样品的处理：直接粉末法、溶剂提取法 2 2、制片：压片法、涂片法、制片：压片法、涂片法 3 3、光谱分析：不需要确定光谱中各主要吸收峰的归属，、光谱分析：不需要确定光谱中各主要

13、吸收峰的归属，只在只在4000-400cm 4000-400cm 范围内比较光谱的差异。范围内比较光谱的差异。A A、在某一波数处，一方有明显吸收峰，另一方无。、在某一波数处，一方有明显吸收峰，另一方无。B B、在某一波数内，两吸收峰的形状强度有明显不同。、在某一波数内，两吸收峰的形状强度有明显不同。C C、被鉴别双方在指纹区的特征不同。、被鉴别双方在指纹区的特征不同。上述三种，只要有其中一种就可做出鉴别结论。上述三种，只要有其中一种就可做出鉴别结论。-1应用举例应用举例 包括相对密度、旋光度、折光率、凝点、熔点等。对于油包括相对密度、旋光度、折光率、凝点、熔点等。对于油脂类、挥发油类及树脂类

14、药材的真实性和纯度鉴别具有特别重脂类、挥发油类及树脂类药材的真实性和纯度鉴别具有特别重要的意义。要的意义。相对密度相对密度熔点熔点区别或检区别或检查生药的查生药的纯杂程度纯杂程度区别或检区别或检查生药的查生药的纯杂程度纯杂程度测定含量测定含量折光率折光率区别不同区别不同的油类或的油类或检查生药检查生药纯杂程度纯杂程度旋光度、凝点旋光度、凝点首选有效或活性成分，如含有多种活性成分，应尽可能选择与中医用药首选有效或活性成分，如含有多种活性成分，应尽可能选择与中医用药功能与主治相关成分功能与主治相关成分为了更全面控制质量，可以采用同一方法测定为了更全面控制质量，可以采用同一方法测定2个以上多成分含量

15、，一个以上多成分含量，一般以总量计制订含量限度为宜般以总量计制订含量限度为宜对于尚无法建立有效成分含量测定，或虽已建立含量测定，但所测定成对于尚无法建立有效成分含量测定，或虽已建立含量测定，但所测定成分与功效相关性差或含量低的药材和饮片，而其有效成分类别又清楚的，分与功效相关性差或含量低的药材和饮片，而其有效成分类别又清楚的，可进行有效类别成分的测定，如总黄酮、总生物碱、总皂苷、总鞣质等可进行有效类别成分的测定，如总黄酮、总生物碱、总皂苷、总鞣质等的测定的测定含挥发油成分的，可测定挥发油含量含挥发油成分的，可测定挥发油含量某些品种，除检测单一专属性成分外，还可测定其他类别成分，如五倍某些品种，

16、除检测单一专属性成分外，还可测定其他类别成分，如五倍子测定没食子酸及鞣质；姜黄测定姜黄素及挥发油含量等子测定没食子酸及鞣质；姜黄测定姜黄素及挥发油含量等应选择测定原形成分，不宜选择测定水解成分应选择测定原形成分，不宜选择测定水解成分不宜采用无专属性的指标成分和微量成分（含量低于万分之二的成分）不宜采用无专属性的指标成分和微量成分（含量低于万分之二的成分）定量定量含量测定成分的确定含量测定成分的确定DNA 分子鉴定20世纪世纪90年代中后期开始年代中后期开始解决形态鉴定的某些局限解决形态鉴定的某些局限 同属多来源药材的鉴别同属多来源药材的鉴别 道地药材的鉴别等道地药材的鉴别等特点：稳定性、多样性

17、、化学稳定性方法：RFLP、PCR、RAPD等应用：植物分类、中药材鉴别、道地生药鉴定PCR(Polymerase chain reaction)PCR fragmentsInterested DNA sequencesPrimerPrimerIdentification of TCM by DNA Molecular MarkerExtracts Genomic DNADNA sequencing寻找特征性基因找特征性基因PCR-RFLPDNA ChipDiagnostic PCRDNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用1在植物进化、分类、鉴定中的应用应用分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA

18、变异情况，从而揭示物种的亲缘关系，为物种鉴定及系统学研究提供依据。采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。2 2在中药材鉴别中的应用在中药材鉴别中的应用通常PCR扩增的模板DNA都来自新鲜的动植物组织材料，因DNA分子遗传标记方法用于生药鉴别中，首先要解决的问题是能否从干的或陈旧的生药样品中提得生药本身的DNA，并能用于PCR扩增，这方面已有成功的报道。用RAPD方法对人参、三七及4种人参伪品的DNA进行PCR扩增，所得DNA指纹图谱可用于区别人参属的3种生药及伪品。3 3在道地生药鉴定中的应用在道地生药鉴定中的应用一个物种的种内多样性是道地药材品质形成的生物学基础。道地生药与非道地生药的本质区别是作用物质基础有效成分的差异，其形成主要受遗传因子和环境因子的影响。应用DNA遗传标记技术，比较道地生药与非道地生药的基因差异，将有助于阐明道地生药的成因。