级组织学技术 PPT课件.ppt

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1、组织学技术组织学技术概述、切片制备概述、切片制备 付文玉付文玉2008.9.10概概 述述 光镜技术光镜技术石蜡切片术石蜡切片术（paraffin sectioningparaffin sectioning）苏木精苏木精-伊红染色伊红染色,简称简称HEHE染色染色（hematoxylin-eosin staininghematoxylin-eosin staining）HEHE染色，脑垂体染色，脑垂体扫描电镜术（扫描电镜术（scanning scanning electron microscopy,SEMelectron microscopy,SEM）：）：观察组织细胞表面结构观察组织细胞表面

2、结构电镜技术电镜技术透射电镜术（透射电镜术（transmission transmission electron microscopy,TEMelectron microscopy,TEM）：）：观察细胞内部结构观察细胞内部结构Transmission Electron Microscope浆细胞浆细胞血细胞血细胞组织化学技术组织化学技术 一般组织化学一般组织化学 （Classical histochemistryClassical histochemistry）免疫组织化学免疫组织化学 （immunohistochemistryimmunohistochemistry）原位杂交原位杂交 （i

3、n situin situ hybridization)hybridization)兔肝兔肝PAS反应反应图像分析术图像分析术-形态计量术形态计量术 应用数学或统计学原理对组织切应用数学或统计学原理对组织切片提供的平面图像进行分析，从而获片提供的平面图像进行分析，从而获得立体的组织和细胞内各种有形成分得立体的组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等参数，从量的数量、体积、表面积等参数，从量的角度显示结构和功能的关系。的角度显示结构和功能的关系。细胞培养术和组织工程细胞培养术和组织工程细胞培养术：把从机体取得的细细胞培养术：把从机体取得的细胞在体外模拟体内的条件下进行胞在体外模拟体内的条件

4、下进行培养的技术。培养的技术。组织工程：细胞培养术在体外模组织工程：细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。拟构建机体组织或器官的技术。实验中的组织工程耳实验中的组织工程耳石蜡切片的制备石蜡切片的制备基本操作步骤基本操作步骤 取材、固定取材、固定 洗涤、脱水洗涤、脱水 透透 明明 浸蜡、包埋浸蜡、包埋 切切 片片 染染 色色 脱水、透明、封片脱水、透明、封片 一、取材、固定一、取材、固定 1.动物致死法 v 麻醉麻醉v 空气栓塞空气栓塞v 颈椎脱臼或断头颈椎脱臼或断头v 股动脉放血股动脉放血（一）取材（一）取材 2.动物选择根据教学或科研目的和要求确定根据教学或科研目的和要求确定。3.取

5、材方法取材顺序取材顺序 先腹腔，后胸腔、先腹腔，后胸腔、盆腔，最后取神经系统盆腔，最后取神经系统肌组织：纵切后结扎固定，以防肌组织：纵切后结扎固定，以防因收缩而出现波浪形变化。取纵、因收缩而出现波浪形变化。取纵、横切面；横切面；肝脏：右前叶或左外叶中部。纵肝脏：右前叶或左外叶中部。纵切或冠状切面；切或冠状切面；胆囊：取胆囊体部，附于滤纸，胆囊：取胆囊体部，附于滤纸，洗去胆汁后固定；洗去胆汁后固定；组织、器官取材举例组织、器官取材举例胰腺：取含有较多胰岛的胰尾部。胰腺：取含有较多胰岛的胰尾部。胃：取胃底或胃体。附于滤纸，防胃：取胃底或胃体。附于滤纸，防止卷缩；止卷缩；肾脏：纵剖，再做扇形切面，皮

6、、肾脏：纵剖，再做扇形切面，皮、髓质均有。髓质均有。4.外科活体组织取材q临床手术取材：多用于肿瘤组临床手术取材：多用于肿瘤组织。包括肿瘤及其周围组织；织。包括肿瘤及其周围组织；q活体小组织：包埋时注意切片活体小组织：包埋时注意切片的面，因体积较小，仔细操作的面，因体积较小，仔细操作5.取材注意事项 动作轻、快，保证组织新鲜动作轻、快，保证组织新鲜;保持组织清洁保持组织清洁;力求组织块小而薄力求组织块小而薄;一刀切取，避免挤压一刀切取，避免挤压;尽量保持组织原有形状尽量保持组织原有形状;部位准确，切面合适部位准确，切面合适;切除不需要的部分切除不需要的部分（二）固定（二）固定 1.意义和目的

7、使要观察的组织结构尽量接近于生前使要观察的组织结构尽量接近于生前的正常状态。的正常状态。防止组织细胞死后的变化和自溶；防止组织细胞死后的变化和自溶；使细胞内的可溶成分转变为不溶性物质；使细胞内的可溶成分转变为不溶性物质；使细胞内成分沉淀、凝固后产生不同的使细胞内成分沉淀、凝固后产生不同的 折射率和对染料的亲和力；折射率和对染料的亲和力；增加组织硬度，利于切片；增加组织硬度，利于切片；防止组织过度收缩或膨胀防止组织过度收缩或膨胀 2.注意事项 p动作迅速动作迅速，保持组织新鲜；，保持组织新鲜；p防止组织因固定而发生变形；防止组织因固定而发生变形；p使用使用新配制新配制的固定剂；的固定剂；p固定剂

8、的固定剂的用量用量:组织块体积的组织块体积的10-10-1515倍倍 ；p固定的固定的时间时间依组织的种类、性质、依组织的种类、性质、大小、固定剂的种类、性质、渗大小、固定剂的种类、性质、渗透力而定；透力而定；p固定过程中固定过程中时常摇动时常摇动；p作好作好记录记录，组织名称、固定液、，组织名称、固定液、时间等时间等3.固定液的种类 单纯固定液单纯固定液 甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、氯化汞、等氯化汞、等 混合固定液混合固定液 CarnoyCarnoy液、液、BouinBouin液、液、ZenkerZenker液等液等 4.固定的方式 特殊固定法特殊固定法 灌注固定灌注

9、固定蒸气固定蒸气固定常规固定法常规固定法二、二、洗涤、脱水、透明、浸蜡、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋包埋（一）洗涤（一）洗涤 目的目的 停止固定液对组织的作用，停止固定液对组织的作用，利于脱水、切片和染色。利于脱水、切片和染色。方法方法固定液以水配制者固定液以水配制者流水冲洗；流水冲洗；固定剂含乙醇者固定剂含乙醇者不冲洗，或用与不冲洗，或用与固定剂中乙醇浓度相近的乙醇冲洗；固定剂中乙醇浓度相近的乙醇冲洗；特殊固定液洗涤法特殊固定液洗涤法（二）脱水（二）脱水目的和原则目的和原则 用某些溶剂逐步将组织用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，块吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或以利于透明剂和

10、石蜡或火棉胶的渗入。火棉胶的渗入。种类和效果种类和效果 非石蜡溶剂的脱水剂：乙醇、丙酮等非石蜡溶剂的脱水剂：乙醇、丙酮等脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇和环氧六烷等环氧六烷等（三）透明（三）透明目的目的 便于透蜡包埋。大多数脱水便于透蜡包埋。大多数脱水剂与石蜡不相混合，通过透剂与石蜡不相混合，通过透明剂的作用才能透蜡。明剂的作用才能透蜡。种类种类 二甲苯、苯、甲苯、氯仿等二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。（四）浸蜡（透蜡）（四）浸蜡（透蜡）目的和方法目的和方法 脱水、透明后的组织脱水、透明后的组织用石蜡、火棉胶、明胶等支持剂透用石蜡、火棉胶、明胶等支持剂透入其内部，替代组

11、织中的透明剂，入其内部，替代组织中的透明剂，并渗入组织内部使软组织变为适当并渗入组织内部使软组织变为适当硬度的蜡块，以利于切片和观察。硬度的蜡块，以利于切片和观察。浸蜡剂的种类浸蜡剂的种类 石蜡、火棉胶、明石蜡、火棉胶、明胶等胶等 （五）包埋（五）包埋1.石蜡包埋法常用的方法浸蜡浸蜡软蜡软蜡I软蜡软蜡II硬蜡硬蜡54-56 56-58 2.快速石蜡包埋法用于快速诊断包埋过程包埋过程包埋注意事项包埋注意事项3.火棉胶包埋法用于大块组织和眼球4.碳蜡包埋法、明胶包埋法不常用三、组织制片法三、组织制片法-切片切片（一）石蜡切片法（一）石蜡切片法 1.切片前的准备工作 载波片的处理；载波片的处理；防脱

12、片剂的选择；防脱片剂的选择；修块；修块；备刀备刀 2.切片过程 3.石蜡切片常遇到的问题及解决的方法 4.切片注意事项 （二）冰冻切片法（二）冰冻切片法 1.制备石蜡切片的基本步骤。制备石蜡切片的基本步骤。2.组织取材和固定的注意事项。组织取材和固定的注意事项。思考四、染四、染 色色 将染料配成溶液，将组织切片浸将染料配成溶液，将组织切片浸入染色剂中，使组织、细胞等成分入染色剂中，使组织、细胞等成分被染上深浅不同的颜色，产生不同被染上深浅不同的颜色，产生不同的折光率，便于在光镜下观察。的折光率，便于在光镜下观察。1.1.目的目的2.2.染料特性染料特性 染料是有机化合物，在其分子染料是有机化合

13、物，在其分子结构中有特殊功能的基团，发色团结构中有特殊功能的基团，发色团和助色团。和助色团。3.3.染色原理染色原理尚不完全清楚。尚不完全清楚。化学反应；化学反应；物理作用：吸附作用、吸收作用物理作用：吸附作用、吸收作用 4.4.常规染色技术常规染色技术HEHE染色染色 苏木精苏木精（HematoxylinHematoxylin）为碱性）为碱性染料，能将细胞核染成蓝色染料，能将细胞核染成蓝色；伊红伊红（EosinEosin）为酸性染料，常）为酸性染料，常将细胞质染成红色将细胞质染成红色 HEHE染色的步骤和方法染色的步骤和方法 蓝化蓝化 充分水洗充分水洗 分色分色 伊红染色伊红染色 水洗水洗

14、脱蜡脱蜡 苏木精染色苏木精染色 水洗水洗 复水复水 水洗水洗 脱水脱水 透明透明 封片封片 脱蜡：脱蜡：二甲苯二甲苯I、II，脱蜡必须彻底；，脱蜡必须彻底；复水：梯度酒精，洗去溶解的石蜡和复水：梯度酒精，洗去溶解的石蜡和二甲苯；二甲苯；水洗：普通水洗，蒸馏水洗；水洗：普通水洗，蒸馏水洗；苏木精染色：染色时间苏木精染色：染色时间10-15min10-15min；水洗：普通水洗净染液；水洗：普通水洗净染液；分色：盐酸酒精分色，将过染或不需分色：盐酸酒精分色，将过染或不需 要染色的组织成分除去；要染色的组织成分除去；水洗：普通水洗净染液；水洗：普通水洗净染液；氨水蓝化：使细胞核进一步变蓝；氨水蓝化：

15、使细胞核进一步变蓝；充分水洗：洗去盐酸酒精，终止其褪色作充分水洗：洗去盐酸酒精，终止其褪色作用；用；伊红染色：染细胞质，时间勿长；伊红染色：染细胞质，时间勿长；脱水：梯度酒精，一定要彻底；脱水：梯度酒精，一定要彻底；透明：透明：二甲苯二甲苯I、II，确保切片完全透明；，确保切片完全透明；封片：中性树胶封片：中性树胶HEHE染色注意事项染色注意事项 v脱蜡必须彻底；脱蜡必须彻底；v梯度酒精复水；梯度酒精复水；v苏木精染色时间依染液新旧、苏木精染色时间依染液新旧、切片厚薄、温度灵活掌握；切片厚薄、温度灵活掌握；v分色是染色成败的关键；分色是染色成败的关键；v分色后水洗要充分；分色后水洗要充分；v伊红染色要适中；伊红染色要适中；v封片前脱水要彻底封片前脱水要彻底小 结v制备石蜡切片的基本步骤。制备石蜡切片的基本步骤。v组织取材和固定的注意事项。组织取材和固定的注意事项。vHEHE染色的操作步骤和注意事项。染色的操作步骤和注意事项。