DNA提取原理和方法 PPT课件.ppt
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1、 DNA提取方法简介提取方法简介DNA提取的几种方法提取的几种方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNA提取的几种方法提取的几种方法q非基因组非基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原理(植物(植物DNA提取经典方法)提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细
2、胞膜,并与核酸形成复合溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中(该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注:注:CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将
3、其加入冰冷的时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl (pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%(V/V)使用前加)使用前加入入Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境
4、,使提供一个高盐环境,使DNP(脱氧核糖核蛋白(脱氧核糖核蛋白)。)。CTAB溶解细胞膜,溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加入使用前加入vPVP
5、(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。和多糖结合,有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(聚乙烯吡咯烷酮)lPVP 按其平均分子量大小分为四级,习惯上常以按其平均分子量大小分为四级,习惯上常以K值表示,不同的值表示,不同的K值分别代表相应的值分别代表相应的PVP平均分平均分子量范围。子量范围。K值实际上是与值实际上是与PVP水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度有关的特
6、征值,而粘度又是与高聚物分子量有关的有关的特征值,而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量,因此可以用物理量,因此可以用K值来表征值来表征PVP的平均分子量。的平均分子量。通常通常K值越大,其粘度越大,粘接性越强。值越大,其粘度越大,粘接性越强。l l在研磨过程中加入在研磨过程中加入PVP,其中的,其中的CO-N=基有很强的基有很强的结合多酚的能力,从源头上减少了酚类被氧化的机结合多酚的能力,从源头上减少了酚类被氧化的机会。会。l同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇,后者能打巯基乙醇,后者能打断多酚氧化酶中的二硫键,使多酚不易被氧化,随断多酚氧化酶中的二硫键,使多酚不易被氧化
7、,随后经抽提而去除。后经抽提而去除。qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂,在在高高温温(5565)条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度(冰冰浴浴),使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;杂质
8、沉淀,离心后除去沉淀;上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提,反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH 8.0)NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液2.65 水浴 60min,其间缓慢摇动几次。3.加入150ul 的5mol/LKac,混匀,冰浴15min 左右q SDS SDS法流程图法流程图 (以动物组织为例)(以动物组织为例)动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤
9、酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式:玻璃珠法、:玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法:异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式:酶法:酶法q根据细胞裂解方式的不同有:根据细胞裂解方式的不同有:基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法:吸附材料结合法:q根据核酸分离纯化方式的不同有:根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸,低盐高值结合核酸,低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷
10、高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸,高盐低值结合核酸,高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。物,从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法:有机溶剂抽提法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:密度梯度离心法:利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容
11、物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象;时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而
12、复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中,从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液SDS碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA中溶液中溶液1的成分的成分及作用及作用 l溶液溶液 50mM 葡萄糖/10mM EDTA/25mM Tris-HCl,pH=8.0 葡萄糖增稠,使悬浮后
13、的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去 l溶液溶液 0.2M NaOH/1%SDS 破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。l溶液溶液III 3M 醋酸钾/2M 醋酸 l这一步的K置换了SDS(十二烷基磺酸钠)中的Na,得到PDS(十二烷基磺酸钾)沉淀;SDS易与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了,同时基因组DNA也被PDS共沉淀 质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质
14、粒比质粒DNADNA分子大得多,且染色体分子大得多,且染色体DNADNA为为线状分线状分子,而质粒子,而质粒DNADNA为共价闭合环状分子;为共价闭合环状分子;当加热处理当加热处理DNADNA溶液时,线状染色体溶液时,线状染色体DNADNA容易发生变性,共容易发生变性,共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象;在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒淀,而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。中
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