T∕CACM 012-2016 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定.docx

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1、目摇摇次前言玉1摇范围12摇规范性引用文件13摇术语和定义14摇方案25摇仪器设备26摇试剂和溶液配制27检验程序38摇结果判定49摇结果报告410摇质量保证411摇废弃物处理4附录A(资料性附录)金钱白花蛇快速PCR鉴定体系的建立5前摇摇言本标准的全部技术内容为推荐性。本标准是对中华人民共和国药典标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、广东省食品药品检验所。本标准主要起草人:袁媛、黄璐琦、李华、蒋超、杨志业、赵玉洋、何雅莉。请注意本标准的某些内容有可能涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。玉T/CACM0122016金钱白花蛇快速P

2、CR鉴定1摇范围本标准规定了使用快速PCR鉴定金钱白花蛇药材和饮片的通用方法和要求。本标准适用于金钱白花蛇药材和饮片鉴定。2摇规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。中华人民共和国药典(2015年版)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T23632进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3摇术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3郾1送检样品testsample按一定规则取

3、自某一整体的一个或多个部分,并能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体的基础。3郾2DNA提取DNAextraction从样品提取出DNA的方法。3郾3DNA扩增DNAamplification通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应技术实现。3郾4聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷

4、贝数呈几何倍数扩增。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行分析。3郾5阳性对照positivecontrol一般使用对照药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。3郾6阴性对照negativecontrol使用常见伪品药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。3郾7空白对照blankcontrol以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸1T/CACM0122016污染。4摇方案金钱白花蛇快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照药材比较的验证方式,即依据金钱白花蛇

5、特异性DNA序列进行鉴定。利用碱裂解法提取金钱白花蛇模板DNA,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。5摇仪器设备5郾1摇仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。5郾1郾1摇PCR仪使用前应进行温度校准。5郾1郾2摇手持式紫外灯可检测365nm紫外波长。5郾1郾3摇连续可调微量移液枪至少应该包括0郾12郾5滋L、0郾510郾0滋L、10100滋L、1001000滋L规格,并包括配套一次性吸头。5郾1郾4摇保温设备至少应包含4益与-20益温区。6摇试剂和溶液配制除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂;实验用水符合GB/

6、T6682的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期和配制者姓名;PCR试剂应小量分装保存以减少污染;材料及试剂的保存都应有防污染措施。6郾1摇DNA提取缓冲液含有0郾5mol/L氢氧化钠(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)溶液:在800mL去离子水中溶解20郾0gNaOH,冷却至室温后加入10gPVP和10mLTritonX100,溶解后加水定容至1L,分装后过滤除菌。6郾2摇中和缓冲液含有0郾1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)溶液,pH值为8郾0:在800

7、mL去离子水中溶解12郾1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8郾0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。6郾3摇dNTP混合液含有等量dATP、dCTP、dGTP、dTTP,使用时调整浓度至10mmol/L。6郾4摇10伊PCR缓冲液依据不同类型的Taq酶选择对应的10伊PCR缓冲液。6郾5摇20%PVP溶液在80mL去离子水中溶解20郾0gPVP-40,加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷却后-20益保存。6郾6摇10mg/mLBSA溶液在80mL去离子水中溶解1郾0g牛血清白蛋白(BSA),加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷却后-20益保存。6郾7

8、摇TaqDNA聚合酶(5U/滋L)检测用TaqDNA聚合酶应无3爷寅5爷核酸外切酶活性,TaqDNA聚合酶在-20益下保存,使用时置冰上操作。2T/CACM01220166郾8摇金钱白花蛇检测用引物对序列JQBHS郾F:5-GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT-3;JQBHS郾R:5-GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA-3。用灭菌ddH2O将上述引物溶解至10滋mol/L。6郾9摇50伊TAE电泳缓冲液在800mL去离子水中溶解242gTris,37郾2g乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA2H2O,加入57郾1mL的醋酸,充分混匀,加去离子水定容至

9、1L,室温保存,使用时用去离子水50倍稀释。6郾10摇6伊加样缓冲液在80mL去离子水中溶解溴酚蓝250mg,二甲苯青250mg,蔗糖250mg,加水定容至100mL,分装。7检验程序为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA提取、核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。7郾1摇取样送检样品抽样方法参照2015年版中华人民共和国药典四部药材和饮片取样法(通则0211)进行取样。送检样品应可分成2批,每批可分为同样的3份,总量不应少于20g。收样时应检查包装的完整性,并在样品袋上贴上标签,填写采集数

10、据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录,照片随样品一起备档。去除药材和饮片表面附着物,依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。7郾2摇粉碎取送检样品置乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎,必要时加适量液氮研磨。7郾3摇DNA提取称取经预处理的送检样品20mg置2郾0mL离心管中;加入200滋L提取缓冲液,充分混匀;加入800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移500滋L上清液至一新的1郾5mL离心管,加入500滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移上清液作为DNA模板待测或-20益保存备用。每个送检样品必

11、须重复2次,每1次从送检样品提取核酸的过程都必须设置1个提取空白对照。注:使用碱裂解法提取的金钱白花蛇DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜长期保存。7郾4摇核酸扩增首次使用本方法时,应校对PCR仪温控准确性,并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq聚合酶的适用性。7郾4郾1摇对照试验PCR检测应重复2次,并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。7郾4郾2摇PCR反应体系在200滋L的PCR管中进行,反应总体积为25滋L,反应体系包括10伊PCR缓冲液2郾5滋L、dNTP混合液(10mmol/L)1滋L、鉴定引物(10滋mol/L)各0郾2滋L、TaqDNA聚合酶1滋L、模板DNA(

12、1050ng)1滋L,无菌双蒸水19郾1滋L。将反应液充分混匀。7郾4郾3摇PCR反应参数将PCR管置PCR仪内进行PCR反应。反应程序为:94益预变性1min;94益变性10s,62益退火延伸10s,30个循环。对扩增产物进行检测或置4益下保存。3T/CACM01220167郾5摇扩增产物检测7郾5郾1摇荧光染料显色检测PCR反应结束后在PCR反应体系内加入2滋L100伊SYBRGreen玉染料,混匀后于365nm紫外波长下检测荧光,若PCR产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果,反之为阴性结果。7郾5郾2摇琼脂糖凝胶电泳检测取PCR扩增产物,加入6伊上样缓冲液混匀,2%琼脂糖凝胶电泳染色

13、,紫外波长下检测。阴性对照和空白对照无条带,且送检样品与阳性对照在500750bp范围内有一条DNA条带为阳性结果,否则为阴性结果。8摇结果判定在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下,若送检样品与阳性对照一致,则判定测试结果为阳性,否则为阴性。9摇结果报告9郾1摇一般要求定性检测结果应表示为阳性“+冶或阴性“-冶。9郾2摇鉴定报告样品经检测后,实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:送检样品的名称、状态和明确的标识;检测依据;取样方法与日期;储存条件;检测开始和结束日期;检测负责人和实验人员;阳性对照、阴性对照、送检样品;特定

14、方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法;检测结论;检测过程观察到的特别情况;其他需要报告的内容。10摇质量保证检测结果应来自同一实验室样品的两份送检样品。当一份送检样品的结果为阳性,另一份为阴性时,要重新测试。可以适当增加核酸扩增反应体系中DNA模板量,使两份样品得到相同结果。每个样品应至少制备两份DNA,必要时需检测模板DNA的质量,确保提取的DNA片段大于扩增片段。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果不一致,可在检测报告中注明检测低限,检测低限应符合最低含量水平。11摇废弃物处理检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理,有毒有害废弃物应经

15、过除害再进行处理,处理要符合环保要求。4T/CACM0122016附录A(资料性附录)金钱白花蛇快速PCR鉴定体系的建立A郾1摇金钱白花蛇及其伪品资料金钱白花蛇为2015年版中国药典的收录品种,来源于眼镜蛇科环蛇属动物银环蛇BungarusmulticinctusBlyth的幼蛇干燥体。目前药材市场上金钱白花蛇伪品数目很多,质量问题严重,其伪品共分为3大类:淤形态类似的其他种属幼蛇,包括赤链蛇、赤链华游蛇、中国水蛇、铅色水蛇、金环蛇、黄链蛇、黑背白环蛇等;于拼接蛇,系指使用金钱白花蛇头,拼接其他伪品蛇的蛇身制成成品,主要有铅色水蛇画上横纹拼接金钱白花蛇身,或赤链蛇、赤链华游蛇染色后接上金钱白花

16、蛇头制成的伪品;盂把大条的银环蛇切开,加工成小蛇形态,接上金钱白花蛇头制成的伪品。对亳州、安国、玉林、广州、昆明等几个大型药材市场进行走访调查发现,在市场上见到的金钱白花蛇伪品总共有6种,分别为铅色水蛇、中国水蛇、赤链蛇、赤链华游蛇、金环蛇、眼镜蛇,其中最为常见的是赤链蛇和赤链华游蛇。A郾2摇引物设计使用BioEdit软件对正品金钱白花蛇以及黑眉锦蛇、红点锦蛇、滑鼠蛇、赤链华游蛇、赤链蛇等伪品的Cytb序列进行序列比较,找到差异片段,设计鉴定引物5-GAAATTTCGGCTCTATGCTTATA鄄ACCTGTCTTT-3和5-GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA-3,见图A郾

17、1。图A郾1摇金钱白花蛇正伪品序列比对及引物设计结果5T/CACM0122016A郾3摇实验样品采集不同药材市场与13家不同药房金钱白花蛇样品进行方法的适用性检测;采集各大药材市场中存在的24种其他科属蛇类样品进行特异性检测,见表A郾1。表A郾1摇蛇类样品表No郾物种拉丁名采集地个数1乌梢蛇Zaocysdhumnades安徽亳州82乌梢蛇Z郾dhumnades北京同仁堂13乌梢蛇Z郾dhumnades中药资源中心14乌梢蛇Z郾dhumnades北京永安堂15金钱白花蛇Bungarusmulticinctus安徽亳州106金钱白花蛇B郾multicinctus深圳市药品检验所27金钱白花蛇B郾m

18、ulticinctus河北安国17金钱白花蛇B郾multicinctus各大药房137蕲蛇Agkistrodonacutus安徽亳州48蕲蛇A郾acutus安徽黄山19蕲蛇A郾acutus北京同仁堂110蕲蛇A郾acutus北京永安堂111蕲蛇A郾acutus中药资源中心112眼镜蛇Najanaja安徽亳州313孟加拉眼镜蛇Najakaouthia安徽亳州113中国水蛇Enhydrischinensis安徽亳州214铅色水蛇Enhydrisplumbea安徽亳州115铅色水蛇E郾plumbea河北安国116赤链蛇Lycodonrufozonatus安徽亳州317竹叶青Trimeresuruss

19、tejnegeri安徽亳州118王锦蛇Elaphecarinata安徽亳州319王锦蛇E郾carinata深圳市药品检验所120王锦蛇E郾carinata中国食品药品检定研究院121红纹滞卵蛇Oocatochusrufodsata安徽亳州122红纹滞卵蛇O郾rufodsata中国食品药品检定研究院123灰鼠蛇Ptyaskorros安徽亳州224短尾蝮蛇Gloydiusbrevicaudus安徽亳州125蝮蛇Agkistrodonhalys安徽亳州126黑眉锦蛇Elaphetaeniura深圳市药品检验所127黑眉锦蛇E郾taeniura江西昌北128平颏海蛇Pelamisplaturus安徽亳

20、州229三索锦蛇Elapheradiata河北安国130百花锦蛇Elaphemoellendorffi中国食品药品检定研究院131赤链华游蛇Sinonatrixannularis中国食品药品检定研究院132虎斑游蛇Rhabdophistigrinus中国食品药品检定研究院133虎斑游蛇R郾tigrina河北安国134山烙铁头蛇Ovophismonticola中国食品药品检定研究院16T/CACM0122016A郾4摇PCR反应体系的建立在200滋L离心管中进行PCR反应。反应总体积为25滋L,包括10伊PCR缓冲液2郾5滋L、dNTP混合液(总浓度为10mmol/L)1滋L、引物溶液(含正向和

21、反向引物)各0郾2滋L、TaqDNA聚合酶1U、模板/对照DNA(1050ng)1滋L,用无菌双蒸水补足反应体积至25滋L。将反应液振荡混匀,瞬时离心。将PCR管置PCR仪内进行PCR反应。PCR反应程序:94益预变性1min;94益变性10s,62益退火延伸10s,30个循环,获得扩增产物。取出PCR管,对反应产物进行检测或置4益下保存。取5滋L反应液经1郾5%琼脂糖凝胶电泳,染色后接通电源按5V/cm恒压进行电泳20min,电泳结束后,将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。上述PCR各主要参数均经过系统的考察。A郾4郾1摇碱裂解法提取蛇类材料总DNA使用碱裂解法提取蛇类样品总DNA,使

22、用通用引物Cytb-H/Cytb-L进行扩增,以检测所获得蛇类样品总DNA是否适用于PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,所有样品均获得约400bp大小的扩增产物,见图A郾2,说明碱裂解法提取的DNA可以满足PCR反应的要求。图A郾2摇Cytb-H/Cytb-L通用引物扩增结果M:DL2000marker;1:乌梢蛇;2:金钱白花蛇;3:蕲蛇;4:眼镜蛇;5:孟加拉眼镜蛇;6:中国水蛇;7:铅色水蛇;8:铅色水蛇;9:赤链蛇;10:竹叶青;11:王锦蛇;12:王锦蛇;13:王锦蛇;14:红纹滞卵蛇;15:灰鼠蛇;16:蝮蛇;17:黑眉锦蛇;18:平颏

23、海蛇;19:三索锦蛇;20:百花锦蛇;21:赤链华游蛇;22:虎斑游蛇;23:山烙铁头蛇;C:阴性对照A郾4郾2摇金钱白花蛇分子鉴定条件考察使用设计的金钱白花蛇快速PCR鉴定引物对不同产地金钱白花蛇及其混伪品进行扩增,并考察:淤退火温度:58益,60益,62益,64益;于PCR循环数:30,28,26,24,22个循环;盂变性温度:94益,92益,90益,88益,86益,84益;榆变性和退火时间:20s,10s,5s,3s,1s;虞Taq种类:rTaqDNA聚合酶,SpeedSTARHSTaqDNA聚合酶,AptaDNA聚合酶Mix,TransfastTaqDNA聚合酶;愚不同PCR仪:970

24、0型PCR仪(ABI公司),VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪(AppliedBiosystems公司),TC-512型PCR扩增仪(TECHNE公司)。对金钱白花蛇鉴定结果进行考察,结果表明,PCR反应程序中,94益预变性1min后,满足变性温度超过88益,变性时间超过5s,退火温度在5864益之间,退火时间超过5s,循环数超过28个循环参数均可准确鉴定金钱白花蛇,见图A郾3。为增加金钱白花蛇鉴定的稳定性,标准制定参数均在此基础上有所提高。最终确定金钱白花蛇快速PCR鉴定的反应程序为:94益预变性1min;94益变性10s,62益退火延伸10s,30个循环。A郾4郾3摇方法的适用性与特异

25、性考察采用上述确定的程序,对金钱白花蛇13批样品及20批伪品进行鉴定(图A郾4、图A郾5),结果表明该体系能稳定准确地鉴定金钱白花蛇。7T/CACM0122016图A郾3摇金钱白花蛇快速PCR反应的优化1:金钱白花蛇;2:眼镜蛇。A:VeritiPCR扩增仪(AppliedBiosystems公司);B:9700型PCR扩增仪(ABI公司);C:TC-512型PCR扩增仪(TECHNE公司)。a:rTaq(Takara公司);b:SpeedSTARHSTaq(Takara公司);c:TransfastTaq(TransGen公司);d:AptaTaq(Roche公司)图A郾4摇金钱白花蛇快速P

26、CR鉴定不同批次正品M:DL2000Marker;1:阳性对照;2-14:金钱白花蛇;15:阴性对照;16:空白对照图A郾5摇金钱白花蛇快速PCR鉴定伪品M:DL2000Marker;1:阳性对照;2:金钱白花蛇;3:黑眉锦蛇;4:红点锦蛇;5:灰鼠蛇:6:赤链华游蛇;7:赤链蛇;8:中国水蛇;9:短尾蝮蛇;10:眼镜蛇;11:乌梢蛇;12:蝮蛇;13:金环蛇;14:铅色水蛇;15:王锦蛇;16:百花锦蛇;17:虎斑颈槽蛇;18:山烙铁头;19:三索锦蛇;20:平颏海蛇;21:蕲蛇;22:双环蛇;23:阴性对照;24:空白对照8T/CACM0122016A郾5摇PCR产物荧光检测在金钱白花蛇及其伪品特异性PCR扩增产物中加入2滋L100伊SYBRGreen玉于365nm紫外波长下检测荧光,结果仅正品金钱白花蛇有强烈绿色荧光,伪品无荧光,表明通过特异性PCR使用荧光颜色可特异性鉴定金钱白花蛇,如图A郾6。图A郾6摇金钱白花蛇快速PCR鉴定结果b:金钱白花蛇;1:眼镜蛇;2:赤链蛇;3:王锦蛇;4:灰鼠蛇;5:空白对照9