T∕CACM 013-2016 金银花快速 PCR 鉴定.docx

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1、ICS ： 1 1 . 120 . 99C1 0/29团体 标 准T/CACM 01 3 201 6金银花快速PCR鉴定Quickly PCR identification of Lonicerae Japonicae Flos2016- 12- 12 发布2016- 12- 12 实施中 华 中 医 药 学 会 发 布目 次前言 玉1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 方案 25 仪器设备 26 试剂和溶液配制 27 检验程序 38 结果判定 49 结果报告 410 质量保证 411 废弃物处理 5附录 A 6前 言本标准的全部技术内容为推荐性。本标准是对 中华人民共和国药

2、典 标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位 : 中国中医科学院中药资源中心 、国药种业有限公司。本标准主要起草人 : 袁媛 、黄璐琦 、蒋超 、赵玉洋 、周骏辉 、何雅莉 、王继永。请注意本标准的某些内容有可能涉及专利 , 本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。玉T/CACM 0132016金银花快速 PCR 鉴定1 范围本标准规定了使用快速 PCR 鉴定金银花药材和饮片 、种子种苗的通用方法和要求。 本标准适用于金银花药材和饮片 、种子种苗鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注日期的引用文件 , 其随后所有 的修改单 ( 不

3、包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准 。凡是不注日期的引用文件 , 其最新版 本适用于本标准。 中华人民共和国药典GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 23632 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T 3543郾 5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T 3543郾 1 农作物种子检验规程总则3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3郾 1送检样品 test sample按一定规则取自某一整体的一个或多个部分 , 并能反映该整体的相关信息 , 可以作为判断该整体的基础。3郾 2DNA 提取

4、DNA extraction从样品中提取出 DNA 的方法。3郾 3DNA 扩增 DNA amplification通过一定技术使一段特定的 DNA 片段拷贝数增加的过程 , 可通过聚合酶链式反应扩增技术实现。 3郾 4聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ( PCR)模板 DNA 先经高温变性为单链 , 两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退 火 , 在 DNA 聚合酶的作用下 , 以四种脱氧核糖核酸 ( dNTP) 为底物 , 使退火引物得以延伸 , 然后不 断重复变性 、退火和延伸这一循环 , 使位于两段已知序列之间的 DNA 片段拷贝

5、数呈几何倍数增长。 其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行检测。3郾 5阳性对照 positive control一般使用对照样品代替送检样品同法 DNA 提取 、靶核酸扩增和产物检测过程 , 用于证明鉴定过 程可获得目标核酸片段的操作。3郾 6阴性对照 negative control使用常见伪品药材代替送检样品同法 DNA 提取 、靶核酸扩增和产物检测过程。1T/CACM 01320163郾 7空白对照 blank control以水代替送检样品同法 DNA 提取 、靶核酸扩增和产物检测过程 , 用以证明提取过程中没有核酸污染。3郾 8对照样品 standard sample对照样

6、品包括对照药材和种子种苗对照样品 。种子种苗对照样品是由中药材种子种苗标准起草单 位提交 , 经全国中药材种子 ( 种苗) 标准化技术委员会认定并保存 , 与品种名称相符的种子种苗 样品。4 方案金银花快速 PCR 鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照样品比较的验证方式 , 即依据金银 花特异性 DNA 位点差异 , 使用单核苷酸多态性标记法进行鉴定 。利用碱裂解法提取金银花模板 DNA , 以提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增 , 荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。5 仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。5郾 1PCR 仪使用前应进行温度校准。5郾 2 手

7、持式紫外灯可检测 365nm 紫外波长。5郾 3 连续可调微量移液枪吸头。至少应该包括 0郾 1 2郾 5滋L 、0郾 5 10郾 0滋L 、10 100滋L 、100 1000滋L 规格 , 并包括配套一次性5郾 4 保温设备至少应包含 4益 与 - 20益 温区。6 试剂和溶液配制除另有规定外 , 实验试剂为不含 DNA 和 DNase 的分析纯或生化试剂 ; 实验用水符合 GB/T 6682 的要求 ; 所配制的试剂均应灭菌后保存 , 并在容器上注明试剂名称 、浓度 、配制时间 、保存条件 、失 效日期和配制者姓名; PCR 试剂应小量分装保存以减少污染 ; 材料及试剂的保存都应有防污染

8、措施。 6郾 1 DNA 提取缓冲液醚 (Triton X 100 ) 溶液 : 在 800mL 去离子水中溶解 20郾 0g NaOH , 冷却至室温后加入 10g PVP 和10mL Triton X 100 , 溶解后加水定容至 1L , 分装后滤过除菌。6郾 2 中和缓冲液含有 0郾 5mol/L 氢氧化钠 ( NaOH) 、1% 聚乙烯吡咯烷酮 - 40 ( PVP - 40) 、1% 聚乙二醇辛基苯基溶解 12郾 1g 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , 冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的 pH 值至 8郾 0 , 加水定容至含有 0郾 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸 ( Tris

9、 - HCl) 溶液 , pH 值为 8郾 0 : 在 800mL 去离子水中1L , 分装后高压灭菌。6郾 3 dNTP 混合液含有等量 dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP , 使用时调整浓度至 10mmol/L。6郾 4 10 伊 PCR 缓冲液依据不同类型的 Taq 酶选择对应的 10 伊 PCR 缓冲液。6郾 5 20% PVP 溶液在 80mL 去离子水中溶解 20郾 0g PVP - 40 , 加水定容至 100mL , 分装后滤过除菌 , 冷却后 - 20益2T/CACM 0132016保存。6郾 6 10mg/ mL BSA6郾 7 中溶解 1郾 0g BSA , 加

10、水定容至 100mL , 分装后滤过除菌 , 冷却后 - 20益 保存。检测用 Taq DNA 聚合酶应无 3 爷 寅5 爷 核酸外切酶活性 , Taq DNA 聚合酶在 - 20益 下保存 , 使用 时置冰上操作。6郾 8 金银花检测用引物对序列JYH郾 R : 5 - TGGATGAGAAATATAACGAATTAG - 3 。用灭菌 ddH2 O 将上述引物溶解至 10滋mol/L。 6郾 9 50 伊 TAE 电泳缓冲液JYH郾 F : 5 - AGTCCCTCTATCCCCAAA - 3 爷 ; 爷在 800mL 去离子水中溶解 242g Tris , 37郾 2g 乙二胺四乙酸二钠

11、 Na2 EDTA 2H2 O , 加入 57郾 1ml 的醋酸 , 充分混匀 , 加去离子水定容至 1L , 室温保存 , 使用时用去离子水 50 倍稀释。 6郾 10 6 伊加样缓冲液在 80mL 去离子水中溶解溴酚蓝 250mg 、二甲苯青 250mg 、蔗糖 250mg , 加水定容至 100mL , 分装。7 检验程序为防止交叉污染 , 收样 、取样 、粉碎 、DNA 提取 、核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同 一操作间不同隔离区域进行 , 进入各区域应严格按照单一方向进行 , 即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。7郾 1 取样送检样品应可分成 2 批 , 每批可分为同样的

12、 3 份 , 总量不低于 100g 。收样时应检查包装的完整 性 , 并在样品袋上贴上标签 , 填写采集数据表 。对商品包装和送样说明进行拍照记录 , 照片随样品一起备档。7郾 1郾 1 药材和饮片送检样品抽样方法参照 2015 年版 中华人民共和国药典 四部药材和饮片取样法 ( 通则 0211)进行取样 。去除药材和饮片表面附着物 , 依次使用 75% 乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。 7郾 1郾 2 种子种苗送验样品 、试样的抽取 、分取应有代表性 。在生产基地取样 , 送验样品可以为组织或器官 ; 在加工或销售地点取样 , 送验样品为种子或种苗。7郾 2 粉碎取送检样品置乳钵 、匀浆机或

13、球磨粉碎仪中充分研磨粉碎 , 必要时加适量液氮研磨。 7郾 3 DNA 提取800滋L 中和缓冲液 , 充分混匀 ; 12000r/min 离心 1min 或静置 5min; 转移 500滋L 上清液至 一 新的称取经预处理的送检样品 20mg 置 2郾 0mL 离心管中 ; 加入 200滋L 提取缓冲液 , 充分混匀 ; 加入作为 DNA 模板待测或 - 20益 保存备用 。每个送检样品必须重复 2 次 , 每 1 次从送检样品提取核酸的 过程都必须设置 1 个提取空白对照。1郾 5mL 离心管 , 加入 500滋L 中和缓冲液 , 充分混匀 ; 12000r/min 离心 1min 或静置

14、 5min; 转移上清液注 : 使用碱裂解法提取的金银花 DNA 可在 4益 下保存 3 天或 - 20益 下保存 7 天 , 不宜长期保存。 7郾 4 PCR 扩增首次使用本方法时 , 应校对 PCR 仪温控准确性 , 并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的 Taq 聚合酶的适用性。3T/CACM 01320167郾 4郾 1 对照试验PCR 检测应重复 2 次 , 并设置阳性对照 、阴性对照和空白对照。7郾 4郾 2 PCR 反应体系在 200滋L 的 PCR 管中进行 , 反应总体积为 25滋L , 反应体系包括 10 伊 PCR 缓冲液 2郾 5滋L 、dNTP0 。分滋L 、Taq D

15、NA 聚 合 酶 1滋L 、模 板 DNA将 PCR 管置 PCR 仪内进行 PCR 反应 。反应程序为 : 94益 预变性 1min; 94益 变性 10s , 62益 退火延伸 10s , 35 个循环 。对扩增产物进行检测或置 4益 下保存。7郾 5 扩增产物检测7郾 5郾 1 荧光染料显色检测PCR 反应结束后在 PCR 反应体系内加入 2滋L 100 伊 SYBR Green 玉染料 , 混匀后于 365nm 紫外波长下检测荧光 , 若 PCR 产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果 , 反之为阴性结果。 7郾 5郾 2 琼脂糖凝胶电泳检测取 PCR 扩增产物 , 加入 6 伊上样

16、缓冲液混匀 , 2% 琼脂糖凝胶电泳染色 , 紫外波长下检测 。阴性 对照和空白对照无条带 , 且送检样品与阳性对照在 100 200bp 有一条 DNA 条带为阳性结果 , 否则为 阴性结果。8 结果判定在阴性对照 、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下 , 若送检样品与阳性对照一致 , 则判定 测试结果为阳性 , 否则为阴性。9 结果报告9郾 1 一般要求定性检测结果应表示为阳性“ + 冶 或阴性“ - 冶 。9郾 2 鉴定报告样品经检测后 , 实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录 , 出具检测报告。 检测报告至少包含以下内容 :送检样品的名称 、状态和明确的标识 ;检

17、测依据 ;取样方法与日期 ;储存条件 ;检测开始和结束日期 ;检测负责人和实验人员 ;阳性对照 、阴性对照 、送检样品 ;特定方法取得的结果 , 结果使用的单位及计算方法 ;检测结论 ;检测过程观察到的特别情况 ;其他需要报告的内容。10 质量保证检测结果应来自同一实验室样品的两份送检样品 。当一份送检样品的结果为阳性 , 另一份为阴性 时 , 要重新测试 。可以适当增加核酸扩增反应体系中 DNA 模板量 , 使两份样品得到相同结果 。每个 样品应至少制备两份 DNA , 必要时需检测模板 DNA 的质量 , 确保提取的 DNA 片段大于扩增片段 。核 酸扩增可设置 PCR 抑制剂对照 。如果

18、经过两次以上从核酸提取开始的重复检测 , 检测结果不一致 ,4T/CACM 0132016可在检测报告中注明检测低限 , 检测低限应符合最低含量水平。11 废弃物处理检测过程中的废弃物 , 收集后在焚烧炉中焚烧处理 , 有毒有害废弃物应经过除害再进行处理 , 处 理要符合环保要求。5T/CACM 0132016附录 A( 资料性附录)金银花快速 PCR 鉴定体系的建立A郾 1 金银花及其伪品资料为绿原酸 、木犀草苷等酚酸 、黄酮类物质 , 临床应用非常广泛。金银花为忍冬科植物忍冬 (Lonicera japonica Thunb郾 ) 的干燥花蕾或带初开的花 , 主要活性成分尽管在 2005

19、年版 中国药典 中已明确将忍冬作为金银花唯一植物来源 , 但之前各版 中国药典 根据临床疗效 、地区用药习惯等 , 曾先后选定忍冬 、红腺忍冬 (L郾 Hypoglauca Miq郾 ) 、华南忍冬L. confusa ( Sweet) DC. 、水忍冬 (L. Dasystyla Rehd. ) 等为金银花的原植物 。且 2005 年版 中国 药典 同时规定红腺忍冬 、华南忍冬 、灰毡毛忍冬 ( L. Macranthoides Hand. - Mazz. ) 和黄褐毛忍 冬 (L. Fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng. ) 列为山银花药材原植物 。此外 ,

20、由于不同地区均有金银 花习用品 , 金银花民间药用非常混乱 。 中国植物志 收载有 102 种忍冬属植物 , 其中作为“ 金银 花冶 中药材商品民间用药的约有 19 种 ( 含变种) 。民间作为“ 金银花 冶 商品用药的忍冬属植物除金 银忍冬 , 盘叶忍冬 、硬毛忍冬外均属于忍冬组缠绕亚组 , 形态学非常类似 , 化学成分上均含有绿原酸 类 , 药理活性有所类似 , 常有混用现象。 中国药典 (2015 年版) 药材鉴定项下收载了金银花性状鉴定和薄层色谱鉴定方法 。但破碎的 中药性状鉴定特征会模糊化甚至消失 , 导致鉴定效力减弱 ; 而通过薄层色谱对供试品中绿原酸进行鉴 定存在一定缺陷 , 主

21、要表现为 : 淤绿原酸在多种植物中均存在 , 作为专属性鉴定成分值得商榷 ; 于该 方法无法鉴定金银花及其近缘种 。与传统中药鉴定方法相比 , 中药分子鉴定具有准确性高 、重现性好 等特点 , 且不受样品形态的限制 , 原药材 、饮片 、粉末乃至含有生药原型的中成药 ( 丸剂 、散剂 等) , 以及中药材种子种苗和种质资源均可应用 , 由于其所需检样量少 , 对珍稀药材及化石标本的鉴 定更具应用价值 。建立金银花快速 PCR 鉴定标准 , 有利于满足中药材和中药饮片 、种子种苗真伪鉴 定的需求 , 保证中药质量可控 。本附录收集了 9 种金银花常见伪品用于设计特异性 PCR 引物 , 具体样品

22、信息见样品表。A郾 2 引物设计金银花 trnL - trnF 序列 625 位 G/T 变异可以准确鉴定金银花及其同属伪品 , 据此位点设计快速PCR 鉴定引物 爷( 见图 A郾 1) 。鉴定引物序列为 : 爷 爷 - TAG - 3 爷 。6T/CACM 0132016图 A. 1 金银花正伪品序列比对及引物设计结果A. 3 实验样品选取来自不同产地的 8 个正品金银花 ( 忍冬) 及忍冬属 9 种 16 个近缘种伪品材料进行快速 PCR研究 。植物样品采自广西 、河南 、山东 、北京 、安徽地区 , 凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和广西药用植物园 。详见表 A郾 1。A. 1

23、丹毒风热毒蕴证可选用的中成药序号物种拉丁名产地个数鉴定人1忍冬Lonicera japonica河南省封丘县4刘红彦2忍冬L郾 japonica山东省临沂市4李圣波3红腺忍冬L郾 hypoglauca广西崇左市2吴庆华4华南忍冬L郾 confusa山东省临沂市1李圣波5灰毡毛忍冬L郾 macranthoides广西南宁市2吴庆华6黄褐毛忍冬L郾fulvotomentosa广西桂林市2余丽莹7水忍冬L郾 dasystyla广西桂林市2余丽莹8金银忍冬L郾 maackii安徽省合肥市1彭华胜9郁香忍冬L郾fragrantissima北京市2郝近大10新疆忍冬L郾 tatarica北京市2郝近大11

24、繁果忍冬L郾 tatarica cv郾 fan - guo 爷北京市2郝近大710g/LBSA 溶液 、1滋L ( 约 10ng) DNA 模板 , 反应程序为 94益 30s , 56益 30s , 72益 45s , 35 个循环 ;T/CACM 0132016A郾 4 PCR 反应体系的建立在 200滋L 离心管中进行 PCR 反应 。20滋L PCR 反应体系包含 2滋L 10 伊 rTaq buffer 、1滋L 10mmol/LBSA 溶液 、1滋L ( 约 10ng) DNA 模板 。将反应液振荡混匀 。将 PCR 管置 PCR 仪内进行 PCR 反应 。 PCR 反应程序 :

25、94益 预变性 1min; 94益 变性 10s , 60益 退火延伸 10s , 35 个循环 , 获得扩增产LdNTPs 、0郾 25滋L10滋mol/L 上游及下游引物 、0郾 5U 快速 Taq 酶 、1滋L 20% PVP - 40 溶液 、0郾 5滋L 10g/物 。取出 PCR 管 , 对反应产物进行检测或置 4益 下保存。束后 , 将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像 。上述 PCR 各主要参数均经过系统的考察。 A郾 4郾 1 碱裂解法提取总 DNA取 5滋L 反应液经 1郾 5% 琼脂糖凝胶电泳 , 染色后接通电源按 5V/cm 恒压进行电泳 20min , 电泳结取

26、20mg 干燥材料 , 使用碱裂解法提取总 DNA , 所提取 DNA 稀释 50 倍用于 PCR 反应 。通用引物10mmol/LdNTPs 、0郾 25滋mol/L 上游及下游引物 、0郾 5U 快速 Taq 酶 、1滋L 20% PVP - 40 溶液 、0郾 5滋L对 trnL郾 F/trnL郾 R 用于 PCR 反应以检测 DNA 质量 , PCR 反应体系包含 2滋L 10 伊 rTaq buffer 、1滋Lb产物 , 与 trnL - trnF 片段大小一致 ( 图 A郾 2) , 说明碱裂解法提取的72益 7min 。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 , 利用 trnL郾 F/t

27、rnL郾 R 引物 , 金银花 ( 忍冬) 及其 9 个同属混图 A郾 2 Amplification result of Lonicera japonica and its adulterants by universal primer trnL郾 F/trnF郾 RM : DL2000 marker; 1 : 忍冬; 2 : 红腺忍冬; 3 : 灰毡毛忍冬; 4 : 华南忍冬; 5 : 黄褐毛忍冬; 6 : 水忍冬; 7 : 金银忍冬 ; 8 : 郁香忍冬; 9 : 新疆忍冬A郾 4郾 2 PCR 反应条件考察利用金银花 ( 忍冬) SNP 鉴定引物 JYH郾 F 和 JYH郾 R 进行位

28、点特异性 PCR 反应 , 并分别考察 :淤退火温度 : 60益 、62益 、64益 、66益 ; 于 PCR 循环数 : 30 、35 、40 个循环 ; 盂 变性温度 : 95益 、 91益 、89益 、87益 、85益 、83益 ; 榆变性和退火时间 : 10s 、5s 、3s 、1s; 虞Taq 种类 : r Taq DNA 聚 合酶 、SpeedSTAR HS Taq DNA 聚合酶 、AptaTaq fast DNA 聚合酶 Mix 、Transfast Taq DNA 聚合酶 ; 愚 不同 PCR 仪 : 9700 型 PCR 仪 ( ABI 公司) 、PTC - 100 型 P

29、CR 仪 ( MJ Research 集团) 、Mastercycler 型 PCR 仪 ( Eppendorf 公司) 、TC - 512 型 PCR 仪 (TECHNE 公司) 对 PCR 反应稳定性的影响。对金银花鉴定结果进行考察 , 结果表明 , 使用快速 PCR 鉴定引物扩增时 , 如当退火温度为 66益时 , 伪品也有荧光 ; 当退火温度为 70益 和 72益 时 , 均无荧光 ; 当退火温度为 68益 时 , 仅正品有荧减少 PCR 反应时间 , 在退火温度为 68益 时 , 逐渐减少循环数 。当循环数为 27 个循环 , PCR 产物光 , 所以金银花快速 PCR 鉴定的最佳退

30、火温度选择 68益 ( 图 A郾 3A) 。出条带 , 故最终选择循环数为 30。出现弱荧光 ( 图 A郾 3B) 。然而 , 当选用 27 个循环时 , 变性 - 退火/延伸的时间低于 20s 时即无法扩增8T/CACM 0132016923622 326431 2 3A30cyle2 3 435cyle2 3 440cyle1 2 3 4B951 2 3 491 1 2 3 4 1852 34872 3 4851 2 3 4832 3 410S2 3 45S2 3 43S2 3 41S2 3 4HSTaq2 34ApataTa42 3Trans Ta42 3r Ta2 34EPCT- 10

31、02 3 4ABI97002 3 4TC-5122 34Mastercyclrt1 2 3 4F图 A郾 3 不同因素对快速 PCR 的影响A : 退火温度 ; B : 循环数 ; C : 变性温度 ; D : 变性时间 , 其中退火时间与变性时间一致 ; E : Taq 酶种类的影响 , 其中 HS Taq 为SpeedSTAR HS Taq DNA 聚合酶 , AptaTaq 为 AptaTaq fast DNA 聚合酶 Mix , Trans Taq 为 Transfast Taq DNA 聚合酶 , r Taq 为 TaKaRa rTaq DNA 聚合酶 ; F : 不同 PCR 仪的

32、影响 , 其中 PCT - 100 完成 PCR 时间为 30min; ABI 9700 为 26min; TC - 512 为 28min; Mastercy鄄cler 为 18min; 1 : 灰毡毛忍冬; 2 : 红腺忍冬; 3 : 忍冬 ( 河南) ; 4 : 忍冬 ( 山东)定金银花真伪品。在此基础上 , 变性温度高于 85益 ( 图 A郾 3C) , 变性及退火时间大于 3s ( 图 A郾 3D) 才能有效鉴在所选择的 4 种 DNA 聚合酶中 , 3 种快速 DNA 聚合酶 SpeedSTAR HS Taq DNA 聚合酶 、AptaTaqPCR 不同 PCR 仪扩增时的稳定性进

33、行考察 , 结果表明 , PCT - 100 、ABI 9700 、TC - 512 型 PCR 仪均fast DNA 聚合酶 Mix 、Transfast Taq DNA 聚合酶均能实现金银花真伪鉴定 ( 图 A郾 3E) 。对金银花快速最终确定金银花快速 PCR 鉴定的 PCR 反应程序为 : 94益 预变性 1min; 94益 变性 10s , 62益 退火可用于金银花快速 PCR 鉴定 ( 图 A郾 3F) 。延伸 10s , 35 个循环。A4郾 3 快速 PCR 鉴定金银花使用快速 PCR 对金银花及其 9 种同属伪品进行扩增 , PCR 扩增条件为 94益 预变性 1min; 9

34、4益 变性 10s , 62益 退火延伸 10s , 35 个循环 。反应结束后在扩增产物中加入 2滋L 100 伊 SYBR Green 玉于荧光 , 取 5滋L 进行凝胶电泳 , 仅金银花扩出约 100bp 大小的条带 , 伪品无条带。365nm 紫外波长下检测荧光 。结果如图 A郾 4 所示 , 金银花正品显示出明亮绿色荧光 , 而伪品不发出T/CACM 0132016A郾 4 金银花快速 PCR 鉴定荧光检测结果M : DL 2000 marker; NTC : 空白对照 ; 1 : 金银花 ( 山东) ; 2 : 金银花 ( 河南) ; 3 : 红腺忍冬 ; 4 : 灰毡毛忍冬 ; 5 : 华南忍冬 ; 6 : 黄褐毛忍冬; 7 : 水忍冬; 8 : 金银忍冬; 9 : 郁香忍冬 ; 10 : 新疆忍冬 ; 11 : 繁果忍冬10