T∕CACM 1027.105-2018 白及快速PCR鉴定.docx

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1、ICS 11.100C 23团 体 标准T/CACM 1027.1052018白及快速 PCR 鉴定Quickly PCR identification of Rhizoma Bletillae2018 - 11 - 19 发布2018 - 11 - 19 实施中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1027.1052018目 次前言 II1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 方案 25 仪器设备使用要求 25.1 总体要求 25.2 仪器设备要求 26 试剂和溶液配制 36.1 总体要求 36.2 试剂和溶液配制要求 37 检验程序 47.1 要求 47.1 程序

2、48 结果判定 69 结果报告 69.1 一般要求 69.2 鉴定报告 610 质量保证 711 废弃物处理 7附录 A（资料性附录） 白及快速 PCR 鉴定体系的建立 8IT/CACM 1027.1052018前 言本标准按照 GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由中华中医药学会提出并归口。本标准主要起草单位：贵阳中医学院，中国中医科学院中药资源中心，广东省药品检验所。 本标准主要起草人：周涛，袁媛，黄璐琦，杨志业，赵丹，蒋超，赵玉洋，周骏辉。IIT/CACM 1027.

3、1052018白及快速 PCR 鉴定1 范围本标准规定了白及快速PCR鉴定的方案、仪器设备使用要求、试剂和溶液配制、检验程序、结果判 定、结果报告、质量保证和废弃物处理的要求。本标准适用于白及药材、饮片、种子和种苗鉴定。2 规范性引用文件下列文件对本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国药典 （2015年版一部和四部）3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1白及 Bletillae Rhizoma兰科植物白及的干燥块茎

4、（参见附录 A）。3.2检验样品 test sample按一定规则取自某一整体，能反映该整体的相关信息，可以作为判断该整体情况的一个或多个部 分。3.3DNA提取 DNA extraction从样品中提取出DNA的方法。3.4DNA扩增 DNA amplification通过一定技术使一段特定的 DNA 片段拷贝数增加的过程。注： 可通过聚合酶链式反应技术实现DNA扩增。1T/CACM 1027.10520183.5聚合酶链式反应（PCR） polymerase chain reaction一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，即DNA片段的特异性体外扩增过程，其特异性依赖 于与目的DN

5、A片段两端互补的寡核苷酸引物。3.6阳性对照 positive control使用对照样品代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程， 用于证明鉴定过程可获得 目标核酸片段的操作。3.7阴性对照 negative control使用常见伪品药材代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程，用于确认检测系统能 够满足白及鉴别的操作。3.8空白对照 blank control以水代替检验样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程， 用以证明提取过程中没有核酸污染 的操作。4 方案白及快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的检验样品与对照样品比较的验证方式， 即依据白及特异性 DNA位

6、点差异，使用SNP（单核苷酸多态性）标记法进行鉴定。利用碱裂解法提取白及DNA，以白及DNA 为模板进行PCR扩增，采用荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。5 仪器设备使用要求5.1 总体要求所有制备样品使用的器具在使用前应进行灭菌处理。5.2 仪器设备要求5.2.1 PCR 仪使用前应进行温度校准。5.2.2 手持式紫外灯能发出波长为365nm的紫外光。2T/CACM 1027.10520185.2.3 连续可调微量移液枪应包括0.1L2.5L、0.5L10.0L、10L100L、100L1000L规格， 并包括配套的一次性 吸头。5.2.4 保温设备应包含4与-20温区。5.2.5

7、 离心设备能离心200L PCR管与1.5mL离心管。5.2.6 电泳仪电源应为具有稳压器的直流电源，电压100V500V。5.2.7 凝胶成像系统系统应包含密封暗箱、摄像头、白光和紫外光（UV）254nm、302nm、365nm光源， UV保护挡板。5.2.8 电子天平最大称量值至少应为1g，可读性精度至少应为1mg。5.2.9 pH计测量范围至少应为014，精度至少应为0.01。5.2.10 研磨设备至少能匀浆20mL的匀浆机，或至少能研磨20mg的粉碎仪器。5.2.11 核酸检测仪波长范围应包含200nm400nm，检测样品量至少应为0.1L，检测精度应不低于2ngL-1。6 试剂和溶液

8、配制6.1 总体要求除另有规定外， 实验试剂为不含DNA和DNA酶的分析纯或生化试剂； 实验用水应符合GB/T 6682无菌 双蒸水或超纯水的要求；所配制的试剂均应灭菌后保存， 并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、 保存条件、失效日期和配制者姓名； PCR试剂应小量分装保存以减少污染； 材料及试剂的保存都应有防 污染措施。6.2 试剂和溶液配置要求6.2.1 DNA 提取缓冲液3T/CACM 1027.1052018含有0.5molL-1氢氧化钠（NaOH）、1%聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）、1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X 100）溶液：在800mL超纯水中溶解20.0g N

9、aOH，冷却至室温后加入10.0g PVP40和10mL Triton X 100， 溶解后加超纯水定容至1000mL，过滤除菌分装使用。6.2.2 中和缓冲液含有0.1molL-1三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）溶液pH8.0：在800mL超纯水中溶解12.1g三羟 甲基氨基甲烷（Tris），冷却至室温后用浓盐酸调节至溶液的pH8.0，加超纯水定容至1000mL，分装后 高压灭菌。6.2.3 Taq 酶（热稳定性 DNA 聚合酶）PCR 预混液0.05 UL-1 Taq聚合酶， 2PCR反应缓冲液， 4mM硫酸镁（MgSO4 ），0.4mM等量的脱氧核糖核苷三 磷酸（dATP，dCT

10、P，dGTP，dTTP）混合物。检测用Taq酶应无35核酸外切酶活性。 Taq酶PCR预混 液在-20下保存，使用时置于冰上操作。6.2.4 白及检测用引物对序列BJ59-412F：5- GCCCAGAACAGCCATCCAAGT -3。BJ59-412R：5- TTGGCACGGAGCGACACG -3。用无菌双蒸水将上述引物溶解至10molL-1。6.2.5 50 TAE（三羟甲基氨基甲烷-冰醋酸-乙二胺四乙酸二钠）电泳缓冲液在800mL无菌双蒸水中溶解242.0g Tris，37.2g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O），加入57.1mL 冰醋酸，充分混匀，加灭菌双蒸水定容至100

11、0mL，使用时用无菌双蒸水稀释50倍。7 检验程序7.1 要求为防止交叉污染， 收样、取样、粉碎、 DNA提取、核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同一操 作间不同隔离区域进行，进入各区域应严格按照单一方向进行，即样品制备区核酸制备区扩增区 检测区。7.2 程序7.2.1 取样7.2.1.1 要求检验样品应分为2批，每批可分为等量的3份，总量不低于100g。收样时应检查包装的完整性，并 在样品袋上贴上标签， 填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录， 照片随样品一起备档。7.2.1.2 药材和饮片检验样品抽样方法按照中华人民共和国药典 （2015年版四部）药材和饮片取样法（通则0211

12、） 进行取样。去除药材和饮片表面附着物，依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。4T/CACM 1027.10520187.2.1.3 种子种苗检验样品、试样的抽取、分取应有代表性。在生产基地取样，送验样品可为组织或器官；在加工 或销售地点取样，检验样品为种子或种苗。7.2.2 粉碎取检验样品置于乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎，必要时加适量液氮研磨。7.2.3 DNA 提取称取经预处理的检验样品20mg置于2.0mL离心管中；加入200L提取缓冲液，充分混匀，在沸腾的 水浴中保存10s15s，取出；加入800L中和缓冲液，充分混匀； 12000rmin-1离心1min或静置5mi

13、n； 转移500L上清液至一新的1.5mL离心管， 加入500L中和缓冲液， 充分混匀； 12000rmin-1离心1min或 静置5min；转移上清液作为DNA模板待测或-20保存备用。每个检验样品应设置两份平行样，每一次 从检验样品提取核酸的过程都应设置一个提取空白对照。注： 使用碱裂解法提取的白及DNA可在4下保存3天或-20下保存7天，不宜长期保存。7.2.4 DNA 质量检测与调整扩增时， 先吸取1L DNA溶液， 采用核酸定量检测仪测定DNA浓度和纯度， 将浓度调整为60ngL-1。注： 使用碱裂解法提取的DNA，不宜使用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量。7.2.5 PCR 扩增7.

14、2.5.1 方法要求首次使用本方法时， 应校对PCR仪温控准确性， 并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq酶PCR 预混液的适用性。7.2.5.2 对照试验送检样品进行PCR检测应设置2份平行样，并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。7.2.5.3 PCR 反应体系在200L的PCR管中进行，反应总体积为25L，反应体系Taq酶PCR预混液7L，鉴别引物各1L （10molL-1 ），DNA模板1L（60ngL-1 ），无菌双蒸水补足。将反应液充分混匀，瞬时离心。7.2.5.4 PCR 反应参数按反应体系加样完成后，瞬时离心，置于PCR仪内，进行PCR反应。设置反应程序为： 95预变性 45

15、s；95变性2s，65退火延伸5s，30次循环。对扩增产物进行检测或置于4下保存。7.2.6 扩增产物检测7.2.6.1 方法要求选用荧光染料显色检测或琼脂糖凝胶电泳检测的任一种检测方法进行扩增产物检测。5T/CACM 1027.10520187.2.6.2 荧光染料显色检测PCR反应结束后，在PCR扩增产物内加入2L 100 SYBR Green I染料，混匀后于365nm紫外波长下 检测荧光，若PCR产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果，反之为阴性结果。7.2.6.3 琼脂糖凝胶电泳检测称取琼脂糖约0.2g，加入1TAE电泳缓冲液10mL，加热至完全溶解，趁热将胶液涂布于大小适宜 （2

16、.5cm7.5cm或4cm9cm）的水平玻璃板，涂层厚度约3mm，垂直插入梳子，静置，待凝胶结成无泡 均匀层，垂直拔出梳子。取PCR扩增产物6L，加入点样孔中。转移胶板至电泳仪中，加入1TAE缓冲 液至没过胶面约3mm处，调节电压至85V、85mA电泳约30min。将凝胶转移至核酸凝胶染色剂（GelRed） 等溶液中染色。将染色后的凝胶转移至紫外凝胶成像系统中观察。阴性对照和空白对照无条带，且检 验样品与阳性对照在350bp450bp之间有一条DNA条带为阳性结果，否则为阴性结果。8 结果判定在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下，若检验样品与阳性对照一致，则判定 测试结果为阳性，

17、否则为阴性。若荧光染料法显色为阴性结果，还应通过琼脂糖凝胶电泳检测方法进行确证。9 结果报告9.1 一般要求定性检测结果应表示为阳性“”或阴性“”。9.2 鉴定报告样品经检测后，实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录，出具检测报告。 检测报告至少包含以下内容：a ）检验样品的名称、状态和明确的标识；b）检测依据；c ）取样方法与日期；d）储存条件；e ）检测开始和结束日期；f）检测负责人和实验人员；g）阳性对照、阴性对照、检验样品；h）检测结论；i）检测过程观察到的特别情况；j）其它需要报告的内容。6T/CACM 1027.105201810 质量保证检测结果应来自同一实验室样

18、品的两份检验样品。当一份检验样品的结果为阳性，另一份为阴性 时， 应重新测试。可以适当调整核酸扩增反应体系中各成分的用量，使两份样品得到相同结果。每个 样品应至少检测2份平行样，核酸定量检测仪检测模板DNA的纯度和浓度，DNA浓度应高于10ngL-1 。 也可采用常规的改良十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）或白及鉴定试剂盒对比提取检验样品DNA的质 量，保证DNA的提取效率，避免出现假阴性结果。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上 从核酸提取开始的重复检测，检测结果不一致，可在检测报告中注明检测低限，检测低限应符合最低 含量水平。11 废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉

19、中焚烧处理，有毒有害废弃物应经过除害再进行处理，处 理应符合环保要求。7T/CACM 1027.1052018附 录 A（资料性附录）白及快速 PCR 鉴定体系的建立A.1 白及与其伪品资料中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂的 治疗。历版中华人民共和国药典（2015 年版一部）规定白及的原植物均为兰科白及属植物白及 BletillastriataRchb. f.。由于白及分布具有地域性， 一些地方中药材标准贵州省中药材、民族 药材质量标准（2003 年版），四川省中药材标准（2010 年版）、甘肃省中药材标准（2009 年版） 以黄花白及 B.

20、ochracea Schltr. 植物作为白及药材的药用来源。通过实地走访和调查发现，由于白 及和同属植物黄花白及、小白及的植物形态相似，只有在开花期才能准确鉴定，市场上以黄花白及、小白及 B. formosana (Hayata) Schltr.、华白及 B. sinensis (Rolfe) Schltr.冒充白及出售的现象 极为普遍，而且以同科植物独蒜兰 Pleionebulbocodioides(Franch.) Rolfe、苞舌兰 Spathoglottis pubescens Lindl.、长距美冠兰 Eulophia faberi Rolfe、竹叶兰 Arundina grami

21、nifolia (D. Don) Hochr.，及市场上称为水白及多为二叶独蒜兰 Pleione scopulorumW.W.Smith、紫花美冠兰 Eulophia spectabilis (Dennst.) Suresh、毛梗兰 Eriodes barbata (Lindl.) Rolfe 植物的块茎作为白及药材 使用的现象也屡见不鲜，白及疗效得不到保证。因此，准确鉴定白及，对白及药材的质量稳定、可控 及临床用药安全、有效具有现实意义。目前，针对白及的鉴别已有一些研究报道，但多以与白及亲缘关系相对较远的百合科植物黄精、 玉竹、射干、知母等植物为对象进行对比鉴别；也有研究显示白及与水白及的表

22、皮细胞特征上有明显 区别，可采用显微鉴别的方法快速鉴定两者。目前尚无有效鉴别白及与黄花白及、小白及等近缘物种 混伪品真伪的方法。DNA分子标记技术因其客观、准确、灵敏的特点， 为中药鉴定提供了技术补充。本 部分白及与其7种近缘混伪品（黄花白及、小白及、华白及、独蒜兰、苞舌兰、长距美冠兰、竹叶兰） 为研究对象，设计白及的特异性鉴别引物， 建立了白及快速PCR鉴定标准， 可用于白及药材、饮片、 种 子、种苗真伪的鉴定，以保障白及的准确种植，药材和饮片质量稳定、可控及临床用药安全、有效。A.2 引物设计白及与其混伪品物种的rDNA-内转录间隔区2 (ITS2)比对特征显示（见图A.1），可根据单个或

23、多 个SNP位点的存在对它们进行鉴别（见表A.1）。依据这些SNP位点， 可将白及与其它物种区分开。因此 针对这些SNP位点设计了多对引物，并未获得鉴别效果较好的引物。鉴于白及与华白及的ITS2区域第3 个碱基位点（表A.1中第1个SNP位点） 为C，其余物种的为T，但白及与华白及的GC含量相差较大， 且与 ITS2的第3个碱基位点相近碱基差异也较大， 因此， 针对该点进一步设计引物， 并调整参数， 引入碱基 错配，以提高退火延伸反应的特异性。通过实验验证显示，根据ITS2的第3个碱基位点设计的引物 BJ59-412F/BJ59-412R能特异性地扩增白及，可作为白及的特异性鉴定引物。最终筛选

24、的白及鉴定引物序列为：BJ59-412F：5- GCCCAGAACAGCCATCCAAGT -3。8T/CACM 1027.1052018BJ59-412R：5- TTGGCACGGAGCGACACG -3SNP位点信息。图A.1 白及正伪品序列部分比对结果表A.1 SNP 位点信息中文学名拉丁学名SNP 位置及对应碱基31934485160140179180182白及B. striataCAGCCCGACC黄花白及B. ochraceaTGACCCAGCT小白及B. formosanaTAACCCAACT华白及B. sinensisCAATTTAGCT独蒜兰P. bulbocodioides

25、TAAGATAATT苞舌兰S. pubescensTGATATAATT竹叶兰A. graminifoliaTAATATAA/GTTA.3 实验样品共收集 46 个批次不同产地白及与其混伪品样本，每批样品约 200g，按批次混合打粉。其中，白及 12 个批次，混伪品 34 个批次。样本信息详见表 A.2。9T/CACM 1027.1052018表A.2 实验样品批次名称拉丁名编号样品类型产地1白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-01植株贵州黔西县2白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-02植株贵州江口县3白及B. striata

26、(Thunb.) Reichb. f.BJ-03药材四川凉山州4白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-04植株贵州雷山县5白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-05药材贵州施秉县6白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-06植株贵州正安县7白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-07植株贵州水城县8白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-08药材安徽六安市9白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-09植株湖南怀化

27、市10白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-10饮片云南大理市11白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-11饮片贵州正安县12白及B. striata (Thunb.) Reichb. f.BJ-12饮片重庆市13黄花白及B. ochracea Schltr.BO-01饮片贵州施秉县14黄花白及B. ochracea Schltr.BO-02植株贵州黔西县15黄花白及B. ochracea Schltr.BO-03饮片贵州清镇市16黄花白及B. ochracea Schltr.BO-04植株贵州雷山县17黄花白及B. ochrac

28、ea Schltr.BO-05药材四川凉山州18黄花白及B. ochracea Schltr.BO-06药材云南丽江市19黄花白及B. ochracea Schltr.BO-07植株安徽六安市20小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-01药材贵州关岭县21小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-02药材贵州紫云县22小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-03植株贵州清镇市23小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-04植株贵州施秉县24小白及B. formosana (H

29、ayata) Schltr.BF-05植株贵州威宁县25小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-06饮片甘肃兰州市26小白及B. formosana (Hayata) Schltr.BF-07药材甘肃兰州市27华白及B. sinensis (Rolfe) Schltr.BS-01植株云南蒙自市28华白及B. sinensis (Rolfe) Schltr.BS-02药材云南蒙自市29华白及B. sinensis (Rolfe) Schltr.BS-03饮片云南蒙自市30独蒜兰Pleione bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-01药材

30、云南昆明市31独蒜兰P. bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-02植株贵州江口县32独蒜兰P. bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-03药材云南丽江市33独蒜兰P. bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-04饮片四川凉山州34独蒜兰P. bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-05植株贵州龙里县35独蒜兰P. bulbocodioides (Franch.) RolfeBB-06饮片云南丽江市36苞舌兰Spathoglottis pubescens Lindl.SP-01植株贵州黎

31、平县37苞舌兰S. pubescens Lindl.SP-02植株贵州龙里县38苞舌兰S. pubescens Lindl.SP-03药材云南蒙自市39苞舌兰S. pubescens Lindl.SP-04植株湖南靖州市40苞舌兰S. pubescens Lindl.SP-05药材云南昆明州41长距美冠兰Eulophia faberi RolfeEF-01植株贵州六枝县42长距美冠兰E. faberi RolfeEF-02药材云南蒙自市43长距美冠兰E. faberi RolfeEF-03饮片四川成都市44竹叶兰Arundinagraminifolia (D. Don)Hochr.AG-01饮

32、片贵州龙里县45竹叶兰A. graminifolia (D. Don) Hochr.AG-02植株贵州罗甸县46竹叶兰A. graminifolia (D. Don) Hochr.AG-03药材贵州兴义县A.4 PCR反应体系的建立A.4.1 一般要求10T/CACM 1027.1052018在 200L 离心管中进行 PCR 反应。 25L 体系，包括 Taq 酶 PCR 预混液 9L，上、下游引物各 1L （10molL-1），DNA 模板 1L（20ngL-1），无菌双蒸水补足。加样完成后混匀、瞬时离心，转移至 PCR 仪内进行 PCR 反应。PCR 反应程序： 95预变性 1min，3

33、5 次循环，95变性 10s，退火延伸 20s，退火延伸温度设置 6 个梯度： 53、56、59、62、65、68,获得扩增产物。取出 PCR 管，对反应产物进行检测 或置于 4下保存。制备 2%琼脂糖凝胶，吸取 5L 特异性扩增产物，加入点样孔中，转移胶板至电泳仪中，加入 1 TAE 缓冲液至没过胶面约 3mm 处， 调节电压至 85V、85mA 电泳约 30min；转移凝胶至 1%的溴化乙锭溶液 中染色后， 置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。在剩余的扩增产物中加入 2L 100SYBR Green I， 混匀后于紫外光下观察，优化引物对 BJ59-412 F/R 鉴别白及的扩增条件，相互

34、验证结果的可靠性。A.4.2 碱裂解法提取总DNA取 20mg 干燥材料，使用碱裂解法提取总 DNA，所提取 DNA 稀释 50 倍后用于 PCR 反应。用 ITS 通 用引物对 P1（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和 p2（5-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3）对所得 DNA 进行 PCR 反应以检测其质量。 25L 体系，包含： Taq 酶 PCR 预混液 11L，上、下游引物各 1L（10molL-1），DNA 模板 1L（40ngL-1），无菌双蒸水补足，反应程序为 94预变性 5min；94变 性 30s，56退火 30s，72延伸 4

35、5s，35 次循环； 72后延伸 2min；4保存。经 1.2%琼脂糖凝胶电 泳检测， 白及与其 7 个近缘混淆品在 500bp700bp 均有单一的条带产生， 扩增产物经测序， 获得序列 大小与 rDNA-ITS 片段大小一致（见图 A.2），与说明碱裂解法提取白及与其 7 个近缘混淆品的 DNA 可以 满足 PCR 反应的要求。图A.2 部分扩增产物的测序峰图11T/CACM 1027.1052018A.4.3 PCR反应条件考察A.4.3.1 利用白及 SNP 鉴定引物 BJ59-412F/R 进行位点特异性 PCR 反应， 在设置的 6 个退火延伸温度 梯度下均能有效扩增白及（条带长度

36、在 350bp400bp，见图 A.3），在 5968目的条带亮度最强， 混伪品均未检测出条带，结合扩增效率与 Taq 酶 PCR 预混液活性，温度选择 65并分别考察：a）变性时间：1s、2s、5s、10s；b）退火延伸时间： 1s、2s、5s、10s、20s；c）PCR 循环数： 25、28、30、35 次循环；d）引物 BJ59-412 F/R 用量： 5molL-1 、7.5molL-1 、10molL-1 、20molL-1 、30molL-1； e）Taq 酶 PCR 预混液用量： 5L、6L、7L、8L；f）DNA 模板用量： 10ng、60ng、120ng、240ng；g）Ta

37、q 酶 PCR 预混液种类： 2Power Taq PCR MasterMix、2Taq PCR Master Mix、2Easy Taq PCR SuperMix、Taq PCR Master Mix、Premix Ex TaqTM Version 2.0；h）不同 PCR 仪： Mastercycler、Applied Biosystems Veriti 96、GeneAmp PCR system 9700 对 PCR 反应稳定性的影响。后一个条件的优选均建立在前一优选结果的基础上进行。A.4.3.2 对白及鉴定考察结果表明， 使用引物对 BJ59-412F/R 快速 PCR 鉴定扩增时，

38、 白及样品在不同 的变性时间、退火延伸时间均能有效扩增（见图 A.4、A.5），为了保证解链完全及特异性退火延伸，选 择变性时间为 2s，退火延伸时间为 5s；当循环次数为 30 次扩增效果最好（见图 A.6）；为避免引物二 聚体的产生， 选择鉴定引物用量均为 10molL-1；当 Taq 酶 PCR 预混液用量在 7L 时， 条带亮度最强； DNA 模板含量为 10ng 时条带较暗， 240ng 时竹叶兰样品有二聚体产生，兼顾产量与特异性，选择模板 DNA 用量 60ng。A.4.3.3 在所选择的 4 种 Taq 酶 PCR 预混液种类中，除 Premix Ex TaqTM Version

39、 2.0 外，均能有效 扩增， 3 种不同厂家型号的 PCR 仪均可用于白及的快速 PCR 鉴定（见图 A.7）。最终确定白及快速 PCR 鉴定的 PCR 扩增条件。扩增程序为：95变性 45s，30 次循环（95变性 2s，65退火延伸 5s）；25L 反应体系： Taq 酶 PCR 预混液 7L，引物 BJ59-412F、BJ59-412R 各 1L （10molL-1），DNA 模板 1L（60ngL-1），无菌双蒸水补足。图A.3 BJ59-412 F/R PCR 不同梯度退火延伸温度扩增电泳图谱（1、9、17、25、33、41：白及， 2、10、18、26、34、42：黄花白及， 3

40、、11、19、27、35、43：小白及， 4、12、20、28、36、44：华白及， 5、13、21、29、37、45：独蒜兰， 6、14、22、30、38、46：苞舌兰， 7、15、23、31、39、47：长距美冠兰， 8、16、24、32、40、48：竹叶兰， M：D2000 DNA 分子量标准）12T/CACM 1027.1052018图A.4 变性时间考察检测图谱（1、9、17、25：白及，2、10、18、26：黄花白及，3、11、19、27：小白及， 4、12、20、28：华白及，5、13、21、29：独蒜兰，6、14、22、30：苞舌兰，7、15、23、31：长距美冠兰， 8、16

41、、24、32：竹叶兰，M：D2000 DNA 分子量标准）图A.5 退火延伸时间检测图谱（1：白及， 2：黄花白及， 3：小白及， 4：华白及， 5：独蒜兰， 6：苞舌兰， 7：长距美冠兰， 8：竹叶兰，M：D2000 DNA 分子量标准）图A.6 循环次数检测图谱（1、9、17、25：白及， 2、10、18、26：黄花白及， 3、11、19、27：小白及， 4、12、20、28：华白及， 5、13、21、29：独蒜兰，6、14、22、30：苞舌兰， 7、15、23、31：长距美冠兰， 8、16、24、32：竹叶兰，M：D2000 DNA 分子量标准）13T/CACM 1027.1052018

42、图A.7 仪器考察检测图谱（1-1、1-2、1-3：Mastercycler、Applied Biosystems Ver itiTM 96、GeneAmp PCR system 9700 扩增； 1、9、17：白及， 2、10、18：黄花白及， 3、11、19：小白及， 4、12、20：华白及， 5、13、21：独蒜兰，6、14、22：苞舌兰，7、15、23：长距美冠兰，8、16、24：竹叶兰，M：D2000 DNA 分子量标准）A.4.4 快速PCR鉴定白及使用快速 PCR 对白及与其 7 种近缘混伪品进行扩增， PCR 扩增条件为 95预变性 45s，30 次循环 （95变性 2s，65

43、退火延伸 5s），反应体系：Taq 酶 PCR 预混液 7L，引物 BJ59-412F、BJ59-412R 各 1L（10molL-1），DNA 模板 1L（60ngL-1），无菌双蒸水补至 25L。反应结束后取 5L 进行琼 脂糖凝胶电泳检测， 仅白及扩出约 350bp450bp 的条带，伪品无条带产生。在扩增产物中加入 2L 100 SYBR Green I，混匀后于 365nm 紫外波长下检测，结果与电泳检测一致（图 A.8）， 白及正品显示出明 亮的绿色荧光，而伪品没有绿色荧光显示。图A.8 不同产地的样本扩增检测图（17： BJ-01BJ-07，8：空白对照， 9：阳性对照， 1015： BO-01BO-06，1620：BF-01BF-05，2123：BS-01BS-03，24