《蛋白表达纯化》课件.pptx

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1、蛋白表达纯化PPT课件contents目录蛋白表达纯化概述蛋白表达系统蛋白纯化方法蛋白纯化流程实验操作注意事项案例分析01蛋白表达纯化概述从细胞、组织或生物体中提取、分离并纯化出目标蛋白的过程。蛋白表达纯化定义目的方法获得高纯度、高活性的目标蛋白，用于结构生物学、药理学、生物医学等领域的研究。包括细胞破碎、离心分离、沉淀、萃取、层析、电泳等。030201蛋白表达纯化的定义通过纯化获得的蛋白质具有较高的纯度，可以用于X射线晶体学、核磁共振等结构生物学方法，解析蛋白质的三维结构，进一步研究其功能。确定蛋白质的结构和功能纯化的蛋白质可以用于药物筛选、药效评估等实验，为新药研发提供关键的实验材料。制备

2、用于药物研发的蛋白质通过纯化特定蛋白质，可以深入研究其在生物过程中的作用以及与疾病的关系，为疾病诊断和治疗提供新的思路。探究生物过程和疾病机制蛋白表达纯化的目的生物医药领域农业领域工业领域基础研究领域蛋白表达纯化的应用领域01020304用于药物研发、蛋白质工程、抗体药物等。用于植物基因工程、转基因作物研究等。用于酶工程、生物催化、生物传感器等。用于解析蛋白质结构与功能、探究生物过程和疾病机制等。02蛋白表达系统原核表达系统通常在相对较低的成本和较短的时间内实现蛋白表达。操作简便原核细胞具有较高的繁殖速度，因此可以快速获得大量的目标蛋白。高表达量原核表达系统蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细

3、胞复杂的翻译后修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。原核表达系统表达的蛋白可能不稳定由于原核细胞缺少真核细胞中的蛋白稳定机制，因此表达的蛋白可能不稳定。表达的蛋白可能没有正确的构象原核细胞缺少真核细胞中的复杂蛋白折叠机制，因此表达的蛋白可能没有正确的构象。原核表达系统在此添加您的文本17字在此添加您的文本16字在此添加您的文本16字在此添加您的文本16字在此添加您的文本16字在此添加您的文本16字真核表达系统的优点表达的蛋白具有正确的构象：真核细胞具有更复杂的蛋白折叠和修饰机制，因此可以表达具有正确构象的蛋白。适用于表达复杂蛋白：真核细胞能够更好地处理复杂蛋白的翻译后修饰，如糖基化

4、等。真核表达系统的缺点操作复杂：相对于原核表达系统，真核表达系统的操作更为复杂，需要更多的时间和成本。表达量相对较低：由于真核细胞的生长速度较慢，因此相对于原核细胞，其蛋白表达量通常较低。真核表达系统酵母表达系统的优点操作简便：酵母表达系统的操作相对简单，可以在短时间内实现蛋白的表达。适用于高通量实验：由于酵母具有快速繁殖的特点，因此适用于高通量实验中大量表达蛋白。酵母表达系统的缺点表达的蛋白可能不稳定：酵母细胞缺少真核细胞的蛋白稳定机制，因此表达的蛋白可能不稳定。糖基化方式不同：酵母细胞的糖基化方式与哺乳动物细胞不同，因此如果需要特定类型的糖基化，酵母表达系统可能不是最佳选择。酵母表达系统昆

5、虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统的优点适用于糖基化蛋白的生产：昆虫细胞具有与哺乳动物相似的糖基化机制，因此适合生产糖基化蛋白。高表达量：昆虫细胞具有较高的繁殖速度，因此可以快速获得大量的目标蛋白。操作相对复杂：相对于原核和酵母表达系统，昆虫细胞表达系统的操作更为复杂。成本较高：由于昆虫细胞培养需要特定的培养基和设备，因此相对于其他系统，其成本较高。昆虫细胞表达系统的缺点03蛋白纯化方法利用不同盐浓度下蛋白质的溶解度差异，通过加入硫酸铵使目标蛋白沉淀析出。硫酸铵沉淀法在低温条件下，利用乙醇与水分子竞争蛋白质水合作用，使蛋白质沉淀析出。乙醇沉淀法利用聚乙二醇与蛋白质结合形成大分子复合物，通过超滤或离

6、心分离达到纯化目的。聚乙二醇沉淀法沉淀法利用高速旋转产生的离心力使不同大小和密度的颗粒分离，常用于亚细胞器及大分子复合物的分离。在离心管中形成连续或不连续的密度梯度，使不同密度的颗粒在梯度中沉降，达到分离目的。离心法密度梯度离心法超速离心法抗体亲和色谱利用特异性抗体与目标蛋白结合，通过洗脱液将结合物洗脱下来，达到纯化目的。酶结合亲和色谱利用目标蛋白与固定化酶的结合能力，通过洗脱液将结合物洗脱下来，达到纯化目的。亲和色谱法疏水作用色谱：利用目标蛋白的疏水性特征，与固定相的疏水表面相互作用，通过逐步改变流动相的极性使目标蛋白与其他杂质分离。疏水色谱法利用目标蛋白的带电性质，与阴离子交换剂结合，通过

7、改变洗脱液的离子强度和pH值，使目标蛋白与其他杂质分离。阴离子交换色谱利用目标蛋白的带电性质，与阳离子交换剂结合，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，使目标蛋白与其他杂质分离。阳离子交换色谱离子交换色谱法04蛋白纯化流程常用的物理方法包括超声波破碎、高压破碎等，化学方法包括用盐酸、氢氧化钠等溶解细胞膜。细胞破碎后，需要将破碎的细胞碎片进行分离，以便后续的纯化步骤。细胞破碎是蛋白纯化的第一步，通过物理或化学方法将细胞破碎，释放出细胞内的蛋白质。细胞破碎初步分离的目的是将蛋白质与其他杂质进行初步的分离，通常采用离心的方法。根据蛋白质的密度不同，可以通过离心将蛋白质与其他杂质进行分离，如细胞核、细胞器

8、等。初步分离后，得到的上清液中仍含有一些小分子杂质，需要进行进一步的纯化。初步分离精细分离的目的是将蛋白质从其他杂质中进一步分离出来，通常采用层析技术。根据蛋白质的大小、电荷、形状等性质不同，可以选择不同的层析方法进行分离。常见的层析方法包括凝胶电泳、离子交换层析、亲和层析等。精细分离纯度检测的目的是确定蛋白质的纯度是否符合要求，通常采用SDS-PAGE电泳和质谱分析等方法。SDS-PAGE电泳可以检测蛋白质的分子量和纯度，而质谱分析可以确定蛋白质的氨基酸序列和修饰情况。纯度检测与鉴定是蛋白纯化的最后一步，也是确保得到的蛋白质能够用于后续实验的关键步骤。纯度检测与鉴定05实验操作注意事项 安全

9、防护措施实验人员应佩戴个人防护装备，如实验服、化学防护眼镜、化学防护手套等，以减少与有毒有害物质的接触。实验区域应保持通风良好，避免有毒有害气体在室内积聚。实验过程中应避免直接接触化学试剂，尤其是腐蚀性、刺激性强的试剂。使用前应检查实验器具是否完好无损，如有损坏应及时更换或维修。使用过程中应严格按照操作规程进行，避免因操作不当导致器具损坏或实验失败。使用后应及时清洗和保养实验器具，保持其清洁干燥，以便下次使用。实验器具的使用与保养使用过程中应控制试剂的用量，避免浪费和环境污染。实验试剂应按照规定的要求进行储存，避免因储存不当导致试剂变质或失效。使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、有效期等信息，确

10、保使用正确的试剂。实验试剂的储存与使用06案例分析总结词重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点详细描述重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。案例一：重组蛋白的表达与纯化膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战总结词膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。详细描述案例二：膜蛋白的表达与纯化案例三：融合蛋白的表达与纯化融合蛋白表达纯化的优势和应用总结词融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的融合蛋白。详细描述感谢您的观看THANKS