三氯卡班对锦鲫的环境健康风险评价定.docx
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1、原创性声明本人声明所呈交的本科毕业论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明。签名:_ 日期:_关于论文使用授权的说明本人完全了解宁德师范学院有关保留、使用毕业论文的规定,即:宁德师范学院有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;宁德师范学院可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵守此规定)签名:_ 导师签名:_ 日期:_摘 要三氯卡班是一种新型的抗菌剂,因有连续
2、、温和、稳定的杀菌特点,被广泛应用于日常生活中。因其具有生物累积性而在环境中长期存在,本实验选择三氯卡班(Chemical class card,简称TCC)和锦鲫作为实验材料,在室内模拟条件下进行半静态染毒实验,研究低浓度10 mg/kg、高浓度100 mg/kg的三氯卡班对锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响。实验结果:在KP 10mg/kg时,锦鲫的SOD酶活性先抑制后诱导上升,CAT酶活性先抑制后诱导再抑制下降,这说明锦鲫的抗氧化防御系统损伤并不明显;在KP100mg/kg时,锦鲫SOD酶活性均受到诱导上升,CAT酶活性均受到抑制下降,这说明锦鲫的抗氧化损伤受到伤害。这说明更高浓度的KP或者更
3、长的暴露时间才会对锦鲫的SOD、CAT酶活性起到显著的诱导和抑制作用,但这些体内表征的变化都说明了三氯卡班能导致锦鲫肝脏的氧化损伤。关键词: 锦鲫;三氯卡班;抗氧化防御系统;SOD;CATAbstractTrichlorocarban is a new antibacterial agent, which is widely used in daily life because of its continuous, mild and stable sterilization characteristics. Because of its bioaccumulation and long-ter
4、m existence in the environment, the chemical class card (TCC) and Carassius auratus (Carassius auratus) were selected as experimental materials in this experiment. Under the indoor simulation conditions, the semi-static toxicity experiment was carried out to study the effects of low concentration of
5、 10 mg / kg and high concentration of 100 mg / kg of triclosan on the antioxidant defense system of Carassius auratus liver. Results: at KP 10mg / kg, the SOD activity of Carassius auratus was inhibited first and then induced to rise, while the cat activity was inhibited first and then induced to fa
6、ll, which indicated that the damage of antioxidant defense system of Carassius auratus was not obvious; at KP 100mg / kg, the SOD activity of Carassius auratus was induced to rise, and the cat activity was inhibited to fall, which indicated that the antioxidant damage of Carassius auratus was damage
7、d. This indicated that higher concentration of KP or longer exposure time could significantly induce and inhibit SOD and cat enzyme activities of Carassius auratus, but the changes of these in vivo characterization indicated that Trichlorocarban could cause oxidative damage of Carassius auratus live
8、r.Key words:Carassius auratus; Trichlorocarban; antioxidant defense system; SOD; CAT;目 录1 引言11.1 三氯卡班的理化性质11.2 三氯卡班在环境中的分布21.3 三氯卡班的毒性作用21.4 三氯卡班的研究进展31.5 锦鲫的抗氧化防御系统31.5.1 生物体的抗氧化防御系统31.5.2 抗氧化防御的机理41.6 本文研究的目的和意义42 实验部分52.1 实验仪器及试剂52.1.1 实验仪器52.1.2 实验试剂52.2 实验过程52.2.1 采样和样品预处理52.2.2 暴露实验52.2.3 总蛋白的
9、测定62.2.4 SOD 酶活性的测定62.2.5 CAT酶活性的测定62.2.6 数据统计分析63 实验结果73.1 蛋白质浓度的变化情况73.2 SOD酶活性的变化情况83.3 CAT酶活性的变化情况83.4 讨论104 结论115 展望11参考文献12致谢14三氯卡班对锦鲫的环境健康风险评价1 引 言由于居民生活质量的不断提高和工业的快速发展,环境中出现了越来越多的人工化学合成品。近几年来,个人护理用品(Pharmaceuticals and Personal Care Products,简称PPCPs)作为一种新型的外来化学物质带来的环境问题日益突出。PPCPs中的主要成分是三氯卡班,
10、因此,人们逐渐深入对三氯卡班的环境问题研究。三氯卡班是一种新型的抗菌剂,因有连续、温和、稳定的杀菌特点,被广泛应用于日常生活中,如纺织品、洗衣粉、除臭剂、皮肤护理品、牙膏和伤口消毒剂等类产品中。三氯卡班与传统的杀菌剂相比,其稳定性和相容性极好,没有异味,化学性质稳定。因其具有生物累积性而在环境中长期存在,本实验选择三氯卡班(Chemical class card,简称TCC)和锦鲫作为实验材料,在室内模拟条件下进行半静态染毒实验,研究低浓度10 mg/kg、高浓度100 mg/kg的三氯卡班对锦鲫肝脏抗氧化防御系统的影响。1.1 三氯卡班的理化性质三氯卡班(Chemical class car
11、d,简称TCC)又名N-(4-氯苯基)-N-(3,4-二氯苯基)脲,分子式为C13H9Cl3N2O,分子量为315.58,熔点为254-256,密度约为1530 KG/m,大部分呈白色微细粉末,无臭味,几乎不溶于水。图1-1三氯卡班化学结构式1.2 三氯卡班在环境中的分布 随着生活质量的不断提高,化学合成品的使用量也越来越大,在城市排水系统和剩余污泥中人们检测到了三氯卡班。研究发现,在城市污水处理系统中,只有21%的三氯卡班被降解,76%吸附于污泥中,3%则保留在出水中。由于三氯卡班的强亲脂性使得附着在底泥或固体等颗粒物中,其浓度可以达到mg/kg的级别。环境中的三氯卡班主要来源是城市污水处理
12、厂中的排水和剩余污泥的排放。除此之外,还有未经过任何污水处理的商业用水和居民用水,直接排入河流,最终汇入至海洋。1.3三氯卡班的毒性作用三氯卡班已污染环境长久,但人们一直没有引起重视,其主要原因是人们一直认为三氯卡班是有效的杀菌剂并且不会对生命造成危害,但是三氯卡班的化学结构同非甾体雌激素(如DES,双酚A等)相类似因此,人们才开始研究该类杀菌剂对环境造成的影响。经研究发现,三氯卡班的毒性会影响哺乳动物的生殖繁衍和幼体动物的发育。研究结果表示,三氯卡班会干扰细胞中睾酮的基因表达,容易造成前列腺异常增大、癌症、生殖功能障碍和发育异常等疾病。水生生物同样也受到三氯卡班的毒性影响。研究三氯卡班对裸藻
13、的形态及繁殖状况的实验中发现低浓度下的三氯卡班时,裸藻的细胞形状没有直接受到影响,但是其叶绿体形态发生了改变;而当三氯卡班的浓度升高时,就会直接影响裸藻结合孢子的数量,影响其有性生殖。将鱼群模拟在室内条件下进行半静态染毒实验,发现在低浓度的三氯卡班下,鱼群的表征性特征发生了变化,鱼群的鳍长发生了改变但并没有改变鱼群的雌雄比例,说明了三氯卡班对鱼类的内分泌产生了一定的干扰。三氯卡班的毒性研究从哺乳动物到水生生物,逐渐深入研究。三氯卡班不仅可以干扰基因表达、干扰内分泌系统,还有可能还会引发癌症、生殖功能障碍和发育异常等病症,成为重大的环境卫生问题。因此本论文对三氯卡班对锦鲤的毒性作用及机制展开系列
14、研究。 1.4 三氯卡班的研究进展研究人员通过对雄性老鼠喂食三氯卡班实验发现,三氯卡班会控制细胞中睾酮的基因表达,造成前列腺异常增大等缺陷。研究人员表示,内分泌干扰物普遍都是遏制或削减激素活动,但是三氯卡班会增加激素活动。达洁灵消毒剂中含三氯卡班和十烷基二甲基甜菜碱,提取了适量悬液做定量杀菌实验、稳定性检测与部分毒性试验。结果表明:三氯卡班有较好杀菌效果,稳定性好,基本无毒、与皮肤有较好的相容性。研究三氯卡班对土壤微生物酶活性的影响实验中发现,随着三氯卡班的浓度增大,土壤中细菌的酶活性有先诱导后抑制的作用,而且作用的时间较长。对于真菌,随着三氯卡班的浓度升高,均表现为诱导作用,但随时间的推移,
15、逐渐表现为先抑制后诱导的作用。对于土壤中蛋白酶和多酚氧化酶活性的研究发现,任何浓度的三氯卡班对其均有抑制作用,但对过氧化氢酶活性有先抑制后诱导的作用。1.5锦鲫的抗氧化防御系统1.5.1 生物体的抗氧化防御系统生物体体内本身就存在一套完整的抗氧化防御系统,当外部污染物进入生物体内时,他们会经历一系列的生物化学变化,并在相关酶的催化作用下,外部污染物被转化成其衍生物,这一过程称为生物转化,所产生的衍生物又称代谢物。生物在对体内的外源污染物进行生物转化时,会形成的中间代谢物,而中间代谢物往往伴随有大量的活性氧如O2-、H2O2和ROOH存在。在正常生理条件下,抗氧化防御系统能调节相关酶的分泌,通过
16、相关酶催化作用有效的清除生物体内产生的活性氧。如果抗氧化防御系统的清除能力跟不上生物体内活性氧的生成速率,大量活性氧在生物体内累计,当活性氧达到一定量后将引起生物体产生氧化应激,对机体造成氧化胁迫,从而对机体造成不可恢复性氧化损伤,使生物体产生中毒反应。抗氧化防御系统的第一道防线是抗氧化酶中的SOD、CAT,主要是去除体内自由基和增强身体抵抗力的作用;抗氧化防御系统的第二阶段是解毒酶GST、GSH-px,其除了能和SOD催化生成的过氧化氢反应,还能除去活性氧与脂质反应得到的脂质过氧化物,将其还原成无毒的醇类和水。而非酶物质,在抗氧化防御系统中通过抗氧化酶的催化与外源污染物代谢的物质结合,从而降
17、低污染物的生物毒性。1.5.2 抗氧化防御的机理抗氧化防御系统分为三步进行抗氧防御:第一步抗氧化防御是防止生物体体内生物转化时产生活性氧自由基,第二步抗氧化防御是依靠抗氧化性的酶类化学物质以及抗氧小分子对已产成的自由基进行清除,第三步抗氧化抗氧化防御是对已氧化损伤的分子进行修复或清除。生物体代谢产生大量活性氧自由基引起氧化应激时,SOD酶和CAT酶共同发挥作用可有效清除体内产生的自由基,维持机体正常的生理平衡。SOD、CAT是抗氧化防御系统的重要防线。其中SOD是水生生物抗氧化防御系统中抗氧化酶的重要组成之一,它能将氧自由基O-2催化从成H2O2,但其生成的H2O2和O2-反应生成有毒的羟基自
18、由基,因此由SOD催化产生的H2O2需要及时清除;而CAT主要催化H2O2转化为H2O和O2,可以降低H2O2的浓度,从而保护机体组织,维持机体细胞内环境的稳定。清除活性氧自由基的反应如下:O-2+2H+ H2O2 +O2 (SOD催化反应)H2O2 H2O +O2 (CAT催化反应)自由基是有氧生物所必需的,但是如果自由基的生成量过大,抗氧化防御系统的抗氧化清除能力不够,不能及时清除,从而受到抑制,长期下来就会导致抗氧化防御系统损伤,抗氧化能力下降。因此,抗氧化酶活性的变化成为鱼类的机体状况依据。1.6本论文研究目的和意义 在现如今,我们不当当要面对由于抗生素的滥用,使得生物耐药性增强,还需
19、要解决抗生素带来的潜在生态毒性。抗生素大多数的研究还是集中在藻类急性毒性和短期毒性,在鱼体上研究较少。这就需要增添这方面的研究数据,所以选取常见的锦鲫作为实验对象,研究在不同三氯卡班浓度下,锦鲫肝脏对脱氢酶的变化情况。通过观察到的变化,初步判断三氯卡班的毒性大小,也会后续的研究提供方向。实验主要通过判断蛋白质浓度、SOD酶活性、CAT酶活性的变化差异而得出结论。2 实验部分2.1 实验仪器及试剂2.1.1 实验仪器高效液相色谱质谱仪(HPLC-ESI-MS)、冷冻离心机 (Beckman,美国)、旋转切片机(L eica rM2015. Germany)、解剖剪、镊子及解剖刀;2.1.2 实验
20、试剂三氯卡班(TCC,纯度:100)购自于上海迈瑞尔化学技术有限公司;二甲苯溶液、福尔马林(国药集团试剂有限公司,上海)、SOD、CAT和蛋白质含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究院,南京),实验中所用的试剂纯度均为100%。2.2 实验过程2.2.1采样和样品预处理锦鲫购于宁德市鱼市场,分别在暴露天数为7、14、30天采样,每组取3条锦鲫,捞取实验用鱼击昏后快速用滤纸吸干表面的水,放在天平上迅速称重,后进行解剖,取出鱼的肝脏,用锡箔纸包好,称重后放入冰箱冷藏备用。2.2.2暴露实验暴露实验是锦鲫模拟在室内条件下进行半静态染毒实验。将锦鲫随机分成若干实验组 ,分别设置三个浓度组(0mgkg-1
21、、10mgkg-1、100mgkg-1)进行单独暴露。光暗比设置为14h:10h,每条鱼喂食量约10 mg/d,一天喂食一次或喂食多次,每天记录鱼的体长和体重,每天及时清除食物残渣和粪便。采集样品时需捞出锦鲫、击晕锦鲫并放在称量盘上,迅速称重,并用仪器测量锦鲫体长和解剖锦鲫各器官,将鱼的腮及肝脏,使用0.9%的生理盐水冲洗干净后,迅速放入-100冰箱或液氮罐中保存备用,保证所取样品是鲜活的。测定样品时,先用滤纸吸干样品表面的水分,迅速称重并放入1:9(质量体积比)的冷生理盐水中,用电动匀浆器匀浆,接着在冷冻离心机上离心15min。离心结束取其上清液测量酶活性。2.2.3 总蛋白的测定总蛋白的测
22、定是根据Liying的方法测定,用考马斯亮蓝G-250作为染料,牛血清白蛋白作为标准蛋白,在游离状态下的G-250呈棕红色,当标准蛋白液或样品与显色剂反应时,溶液成蓝色。特定区间内的蛋白质含量与色素的结合物在595nm下的吸光度随光密度值的增大而增大,用测定的蛋白质含量校正酶的活性。提取适量酶提取液于试管中,滴加3ml考马斯亮蓝G-250染料进行染色,使其充分混合,10分钟后在595nm波长下测量其吸光度,同时用对照管(蒸馏水空白)的吸光度作校正。2.2.4 SOD酶活性的测定SOD酶活性的测定是根据Otting和Flohe(1984)文章中的方法,采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定相关生
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