【生物】动物细胞融合技术与单克隆抗体-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修三.pptx

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1、第第2 2章章细胞工程细胞工程本节聚焦:l什么是什么是动物细胞融合技动物细胞融合技术术？l单克隆抗体是如何制备的？单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？在临床上有哪些应用？第2节 动物细胞工程(二)动物细胞融合和单克隆抗体二、植物体细胞杂交技术课前提问胰蛋 白酶 处理处理取动物组织分散成单个细胞细胞悬液加培养液加培养液 转入培养液中进行培养离心法收集细胞并制成细胞悬液原代培养分裂受阻 转入新的培养液中进行培养传代培养分瓶培养植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故知新：温故知新：植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和障碍，培育出新的作物类型。运用植物体细胞

2、杂交技术，可培育新的作物类型实例：1970年，人鼠细胞荧光标记融合实验人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞37培养40min细胞融合实验表明：细胞膜具有流动性有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交？思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁；全能性受限制，不能培育成新的动物个体。显微镜下的动物细胞融合动物细胞融合概念原理诱导方法使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一定的流动性物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活病毒诱导法一、动物细胞融合技术动物细胞融合特有的诱导方法灭 活 病 毒思考：灭活病毒诱导细

3、胞融合的原理是什么呢？灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。动物细胞融合完成的标志动物细胞融合结果意义运用形成具有原来两个或多个细形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的胞的遗传信息的杂交细胞杂交细胞突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。第一第二第三为制造单克隆抗体开辟了新途径。研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。一

4、、动物细胞融合技术植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性用用果胶酶果胶酶和和纤维素酶纤维素酶去除去除细胞壁细胞壁用用胰蛋白酶胰蛋白酶或或胶原蛋白酶胶原蛋白酶使细胞分散使细胞分散成单个细胞成单个细胞再生出细胞壁再生出细胞壁细胞核的融合细胞核的融合获得完整的杂种植株获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种交育种，培育植物新品种突

5、破了有性杂交的局限，突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能植物体细胞杂交和动物细胞融合比较物理法：电融合法。物理法：电融合法。化学化学法：法：PEGPEG融合法。融合法。生物法：灭活病毒诱导法生物法：灭活病毒诱导法物理法：电融合法、离心法等。物理法：电融合法、离心法等。化学法：化学法：PEGPEG融合法、融合法、高高CaCa2 2高高pHpH融融合法等合法等(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒()(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构()(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然

6、是二倍体细胞()判断下列正误1 1下图表示用仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列相关下图表示用仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列相关叙述叙述正确正确的是的是()A A细胞细胞A A和细胞和细胞B B必须为同种细胞才能融合必须为同种细胞才能融合B B细胞细胞C C同时有细胞同时有细胞A A和细胞和细胞B B的遗传物质的遗传物质C C该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性D D植物细胞的融合过程与动物细胞完全相同植物细胞的融合过程与动物细胞完全相同B2如图为动物细胞融合技术过程图如图为动物细胞融合技术过程图，下列相关叙述下列相关叙述错误错误的的是是()A

7、图中图中过程发生了细胞膜的融合过程发生了细胞膜的融合，体现了细胞膜的选择透过性体现了细胞膜的选择透过性B图图中中C为灭活病毒为灭活病毒，此外还可用此外还可用 物理或化学方法诱导动物细胞融合物理或化学方法诱导动物细胞融合C图中图中过程表示细胞核融合形成杂种细胞过程表示细胞核融合形成杂种细胞D动物细胞动物细胞融合技术可用于制备单克隆抗体融合技术可用于制备单克隆抗体A单克隆抗体血清（抗体主要分布部位）传统抗体制备方法:向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。缺陷：产量低、纯度低，特异性差血清含量有限(一)传统抗体制作方法及缺陷：二、单克隆抗体及其应用二、单克隆抗体及

8、其应用病原体处理呈递辅助性T细胞结合记忆B细胞浆细胞抗体第一信号分裂、分化 并分泌细胞因子分裂分化促进产生分泌第二信号B细胞抗原呈递细胞结合抗体与病原体结合后形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。摄取知识回顾：抗体的产生抗体1抗体2抗体3抗体4.动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种抗原1抗原2抗原3抗原4B细胞1B细胞2B细胞3B细胞4.每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体刺激刺激刺激刺激(一)传统抗体制作方法及缺陷：二、单克隆抗体及其应用问问题题:若若我我们们只只需需要要大大量量的的抗抗体体4 4有有什么办法吗？什么办法吗？若能得到大量的B细胞4就可以需要得到遗憾：如何解决这一难题？B

9、淋巴细胞不能无限增殖一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）(能无限增殖能无限增殖)一种B淋巴细胞(只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体)杂交瘤细胞：既能无线增殖增殖，又能产生专一抗体1975年，米尔斯坦和柯勒二、单克隆抗体及其应用1984年，诺贝尔生理学或医学奖由单一由单一杂交瘤杂交瘤细胞细胞增增殖产生的特异性抗体。殖产生的特异性抗体。注：B淋巴细胞指的是活化的B淋巴细胞（指从成熟的B细胞向浆细胞分化的时期），其融合的效率最高；若直接用浆细胞，融合效率很低。单克隆抗体的制备过程从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞进行培养多种已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细

10、胞诱导融合小鼠的脾脏中获取注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的B淋巴细胞2.单克隆抗体的制备过程：B细胞1B细胞2B细胞3 B细胞4B细胞2B细胞3B细胞4骨髓瘤细胞B细胞1杂交1 杂交2杂交3杂交402杂交瘤细胞（多种）置于选择性培养基上培养 第一次 筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合 未融合的骨髓瘤细胞 2.单克隆抗体的制备过程B瘤B瘤第一次筛选：用特定的用特定的选选择培养基择培养基，在该培养基上，在该培养基上，未融合的亲本细胞未融合的亲本细胞和和融合融合的具有同种核的细胞都会的具有同种核的细胞都会死亡死亡，只有融合的杂交瘤只有融合的杂交瘤细胞细胞才能生长

11、。才能生长。【第一次筛选】获得杂交瘤细胞细胞细胞合成合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径途径能能被被氨基嘌呤阻断阻断。B B淋巴细胞中有这淋巴细胞中有这两种两种DNADNA的合成的合成途径途径，但，但不能分裂增殖不能分裂增殖。鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤细胞中细胞中只有只有D D途径，没有途径，没有S S途径，但途径，但能不断分裂增殖能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤（HAT选择培养基）B，B-B：不能无限增殖，死亡瘤，瘤-瘤：不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞：（B-瘤）能无限增殖，生长D途径、S途径D途径D途径、S途径02杂交瘤细胞（多种）置于选

12、择性培养基上培养 第一次筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合 未融合的骨髓瘤细胞 2.单克隆抗体的制备过程B瘤B瘤第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。第二次筛选第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞 克隆化培养2.单克隆抗体的制备过程96孔板第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞 克隆化培养2.单克隆抗体的制备过程抗原4第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞 抗体检测2.单克隆抗体的制备过程抗体检测呈阳性抗体检测呈阳性第二次筛选：得到能产生所需抗体的杂交瘤细胞

13、抗体检测2.单克隆抗体的制备过程原理：抗原原理：抗原-抗体抗体杂交杂交抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养单克隆抗体体内 或 体外培养注射到小鼠腹腔2.单克隆抗体的制备过程优点：易于控制培养条件，操作简单，成本较低。缺点：规模小，产量少小鼠腹水 或 培养液提取优点：可大规模培养，产量大。缺点：需要认为控制培养条件，成本高 体外培养 或 小鼠腹腔内增殖（培养液提取）（小鼠腹水提取）单克隆抗体未融合和多种杂交细胞多种杂交瘤细胞第一次筛选骨髓瘤细胞分泌特异抗体的杂交瘤细胞多种B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术特异性强灵敏度高可大量制备给小鼠注射特定的抗原单克隆抗体的制备过程选择性培养基第二次筛

14、选原理：抗原-抗体杂交既能大量繁殖又能产生专一抗体 诱导融合 电融合法、PEG、灭活病毒原理：细胞膜的流动性原理：细胞增殖克隆化培养和抗体检测1用特定的抗原对小鼠进行免疫后用特定的抗原对小鼠进行免疫后，从小鼠脾脏中只能得到一种从小鼠脾脏中只能得到一种B淋巴细胞。淋巴细胞。()2单克隆抗体制备过程中的两次单克隆抗体制备过程中的两次筛选目的相同。筛选目的相同。()3制备单克隆抗体时可从未经免疫的小鼠体内提取制备单克隆抗体时可从未经免疫的小鼠体内提取B淋巴细胞。淋巴细胞。()4经特定抗原免疫过的经特定抗原免疫过的B淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体。淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体。()练习与

15、应用提示：从免疫后的小鼠脾脏中获取的是多种B淋巴细胞。提示：第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞，而第二次筛选的目的是获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。提示：制备单克隆抗体时，首先将抗原注入小鼠体内，获得能产生特定抗体的B淋巴细胞。提示：经特定抗原免疫过的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交融合后，筛选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞，然后再进行体外培养或注入小鼠腹腔培养获得单克隆抗体。2 2下列关于单克隆抗体制备的说法，正确的是下列关于单克隆抗体制备的说法，正确的是()A)A将将特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体B B经特定抗原免疫过的经

16、特定抗原免疫过的B B淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体抗体C C诱导诱导B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，发生融合的细胞淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，发生融合的细胞均为杂交瘤细胞均为杂交瘤细胞D D筛选出杂交瘤细胞后，需利用特定抗原再筛选出杂交瘤细胞后，需利用特定抗原再次筛选分泌单克隆抗体的细胞次筛选分泌单克隆抗体的细胞D1 1图中图中B B淋巴细胞、骨髓瘤细胞和淋巴细胞、骨髓瘤细胞和A A细胞各有何特点？细胞各有何特点？3 3过程过程1 1中诱导细胞融合措施是什么？中诱导细胞融合措施是什么？B B淋巴细胞：淋巴细胞：能产生单一抗体，但不能产生单一抗体，但不能

17、无限增殖。能无限增殖。骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能能无限增殖，但不能产生抗体。产生抗体。A A细胞细胞(杂交瘤细胞杂交瘤细胞)：既能产生抗体，既能产生抗体，又能无限增殖。又能无限增殖。2 2制备单克隆抗体时，给小鼠注射特定抗制备单克隆抗体时，给小鼠注射特定抗原后，小鼠体内发生了什么生理过程？原后，小鼠体内发生了什么生理过程？小鼠产生了体液免疫，生成能产生特定小鼠产生了体液免疫，生成能产生特定抗体的抗体的B B淋巴细胞。淋巴细胞。PEGPEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等单克隆抗体的制备小结（1）该过程中应用到的技术_（2）原理_（3）注射特定

18、抗原的目的_（4）诱导融合的方法_ 动物细胞特有的诱导融合方法为_动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的_ 第一次如何筛选_ 筛选原理_ _筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长单克隆抗体的制备小结（6）杂交瘤细胞的特点_（7）第二次筛选的目的_ 如何筛选_ _ 选择抗体检测呈_性的杂交瘤细胞，即_ _（8）抗体检测原理_获得能分

19、泌所需抗体的杂交瘤细胞。进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞_（10）如何获取单克隆抗体体外培养_小鼠腹腔内培养_（11）单克隆抗体的优点_在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取特异性强，灵敏度高，可大量制备阳【资料资料1 1】用用抗抗人绒毛膜促性腺激素人绒毛膜促性腺激素单克单克隆抗体隆抗体做成的做成的“早早孕诊断早早孕诊断试剂盒试剂盒”。在妊娠第。在妊娠第8 8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前

20、了天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在成不利影响。该方法检测的准确率在90%90%以上。以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：3.单克隆抗体的应用作为诊断试剂最广泛的应用抗体药物接头ADC被细胞吞噬释放药物溶酶体裂解细胞凋亡抗体-药物偶联物（ADC）ADCADC通常由通常由抗体、接头和药物抗体、接头和药物(如细胞毒素如细胞毒素)三部分组成三部分组成3.单克隆抗体的应用用于治疗疾病和运载药物生物导弹=单克隆抗体+药物。单克隆

21、抗体：起导向作用，能特异性识别肿瘤抗原药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。归纳：单克隆抗体的应用（1）广泛用作诊断试剂利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。（2）运载药物：如抗体-药物偶联物（ADC）。生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤。(单抗：起导向作用)优点：位置准确、疗效高、副作用小（3）直接用于治疗疾病。1如图所示如图所示，将由将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗简称双抗。下。下列说法列说法错误错误的是

22、的是()A双抗可同时与双抗可同时与2种抗原结合种抗原结合B利用双抗可以将蛋白类药物运送至利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞靶细胞C筛选双抗时需使用制备筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的单克隆抗体时所使用的2种抗原种抗原D同时注射同时注射2种抗原可刺激种抗原可刺激B细胞分化细胞分化为产双抗的浆细胞为产双抗的浆细胞D一种浆细胞只能产生一种抗体，同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株C练习与应用一、概念检测2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A练习与应用一、概念检测