重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx

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1、第1节 重组DNA技术的基本工具第3章 基因工程怎么能让大肠杆菌产生胰岛素呢？不同生物在信息传递过程中都遵循中心法则，并共用同一套遗传密码。1970 史密斯感受态流感嗜血杆菌放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA共同孵化检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内并未检测到放射性标记的噬菌体DNA噬菌体DNA为什么检测不到了？1970 史密斯感受态流感嗜血杆菌放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA共同孵化检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内并未检测到放射性标记的噬菌体DNA噬菌体DNA可能被流感嗜血杆菌降解了实验一实验二噬菌体DNA溶液黏度下降;细菌自身DNA溶液黏度无变化(DNA长度越长，溶液黏度越高)流感

2、嗜血杆菌中可能存在什么物质？1970 史密斯感受态流感嗜血杆菌放射性标记的沙门氏噬菌体的DNA共同孵化检测噬菌体DNA是否转化进入细菌细胞内并未检测到放射性标记的噬菌体DNA噬菌体DNA可能被流感嗜血杆菌降解了实验一实验二噬菌体DNA溶液黏度下降;细菌自身DNA溶液黏度无变化(DNA长度越长，溶液黏度越高)流感嗜血杆菌可能有切断噬菌体DNA的酶任务：根据信封中EcoR1切割DNA分子产生的片段，推测该酶的识别序列及切割位点，并将其填写在活动单上。(请用箭头标出切割位点)EcoR1EcoR1识别序列回文结构切割位点切割位点识别双链DNA中特定核苷酸序列在每条单链特定的部位断开磷酸二酯键磷酸二酯键

3、限制性内切核酸酶（限制酶）EcoR1限制性内切核酸酶（限制酶）分子手术刀黏性末端根据信封B中限制性内切核酸酶切割DNA分子产生的片段，推测这些序列是由几种限制性内切核酸酶切割?请将这些酶的识别序列及切割位点填写在学习单上(请用前头标出切割位点)。任务：平末端尝试用剪刀模拟EcoR1切割DNA（信封C），获得目的基因（人胰岛素基因）任务3需要将目的基因送入细胞的载体 “分子运输车”胰岛素基因（目的基因）质粒独立于拟核外的，小型环状DNA分子。有复制原点，能自我复制复制原点任务4 尝试选择合适的质粒（信封D），将目的基因与所选择的质粒拼接成重组DNA分子。讨论：你选择质粒的原因是什么？只以氢键相连

4、的两个末端是不 是稳定的，如何使重组DNA结构稳定？目的基因质粒重组DNA分子质粒1质粒2“分子运输车”载体有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。具有复制原点，能使目的基因随之复制。有特殊的标记基因，便于重组DNA的筛选。1970年第一个限制酶被发现1972年构建重组DNA分子复制原点“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞重组DNA技术所需的三种基本工具：0101限制性内切核酸酶“分子手术刀”一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1.来源：来源：主要是主要是原核生

5、物原核生物简称简称限制酶限制酶2.种类：种类：数千种数千种注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1.来源：来源：主要是主要是原核生物原核生物简称简称限制酶限制酶2.种类：种类：数千种数千种注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。3.功能功能：能够能够识别识别双链双链 DNA DNA 分子的分子的特定特定核苷酸序列核苷酸序列，并使每一条，并使每一条链中链中特定特定部位部位的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。为什么限制酶不切割原核生物本身的为什么限制酶不切割原核生物本身

6、的DNADNA分子？分子？原核细胞原核细胞DNADNA中中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。限制酶在原核生物中主要起到限制酶在原核生物中主要起到切割外源切割外源DNADNA、起防御作用。、起防御作用。特点：专一性特点：专一性“两个特定”4.识别序列识别序列：一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由_个核苷酸组成，也有少数限制酶个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由的识别序列由_个、个、_个或个或 的核苷酸组成。的核苷酸组成。6 64 48 8其他数量其他数量识

7、别的序列的特点识别的序列的特点均有一条均有一条中心轴线。中心轴线。中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复排列重复排列的的 ，称为回文序列，即：一条链，称为回文序列，即：一条链正正向读向读与另一条链与另一条链反向读反向读的碱基顺序完全一致。的碱基顺序完全一致。注意：限制酶识别过程具有方向性注意：限制酶识别过程具有方向性都是从都是从5353开始读开始读从53正向读与另一条链从53反向读的碱基顺序完全一致一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”6.作用结果作用结果：产生产生黏性末端黏性末端、平末端平末端EcoEcoR R(在在G

8、G与与A A之间切割之间切割)中轴线中轴线黏性末端黏性末端平末端平末端SamSam (在在G G与与C C之间切割之间切割)黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端识别序列识别序列：GAATTCGAATTC切割部位：切割部位：GAGA之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键形成黏性末端（从形成黏性末端（从55往往33读）：读）：AATTAATT形成形成 个相同（互补）的黏性末端个相同（互补）的黏性末端可断开可断开 个磷酸二酯键个磷酸二酯键 消耗消耗 分子分子水水 2 22 2形成形成_个个游离的磷酸基团游离的磷酸基团2 2产生产生_个个切口切口1 12 2黏性末端：黏性末端：限制酶在它识别序列的限制酶在它识别

9、序列的中心轴线两侧中心轴线两侧，将，将DNADNA分子的两条链分别切开分子的两条链分别切开时，切开的时，切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口是正好互补配对，这样的切口是黏性末端黏性末端。平末端：平末端：当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开中心轴线处切开时，切开的时，切开的DNADNA两条单链的切口，两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫是平整的，这样的切口叫平末端平末端。例：例：SmaSma只能识别只能识别CCCGGGCCCGGG序列序列，并，并在在C C和和G G之间之间切开。

10、切开。可断开可断开 个磷酸二酯键个磷酸二酯键 形成形成 个相同平末端个相同平末端消耗消耗 分子分子水水 形成形成_个个游离的磷酸基团游离的磷酸基团2222产生产生_个个切口切口1平末端CGC CG GGCGCGC5335CGC CG GGCGCGCBamH ；EcoR ；Hind ；Bgl 。【练习】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？同种限制酶切割产生的黏性末端相同，不同限制酶可能会形成相同的黏性末端例：限制性例：限制性EcoRIEcoRI的识别序列和切点是的识别序列和切点是G GA

11、ATCCAATCC，补充完整切割过程图：，补充完整切割过程图：限制性限制性SmaISmaI的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGGGGGCCCCCC，补充完整切割过程图：，补充完整切割过程图：GGCTTAACTTAAAATTCAATTC G GGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGEcoRIEcoRIGGGGGGCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGGCCCGGGSma ISma I黏性末端黏性末端平末端平末端两种末端的正确书写两种末端的正确书写二、限制性内切核酸酶二、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”【思考】请判断：以下黏性末端是由_种限制酶

12、作用产生的。3做题技巧：注意观察识别序列和切割位点找到切割位点补全序列练习下图所示的黏性末端属于同一种限制酶切割产生的是（）CA B C D1.1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？可产生几个黏性末端？要切要切两个两个切口，产生切口，产生四个四个黏性末端。黏性末端。2.2.如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同相同的黏性末端的黏性末端3.3.限制酶能切开限制酶能切开RNARNA分子的磷酸二酯键吗？分子的磷酸二酯键

13、吗？不能不能。限制酶限制酶只能只能识别并切开双链识别并切开双链DNADNA分子。分子。二、限制性内切核酸酶二、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”思考思考:4.4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵，但生物在长期的进化过程中的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的形成了一套完善的防御机制防御机制，以防止外来病原物的侵害。，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源，当外源DNADNA侵入时，会利用限侵入时，会利用限制酶

14、制酶将外源将外源DNADNA切割掉切割掉，以保证自身的安全。，以保证自身的安全。所以，所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，从、使之失效，从而达到保护自身的目的。而达到保护自身的目的。二、限制性内切核酸酶二、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”5.5.为什么限制酶不切割细菌本身的为什么限制酶不切割细菌本身的DNADNA分子？分子？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中分子中不不具备这种限制酶的识别切割序列具备这种限制酶的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲

15、基转移到所识通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。思考思考:1 1、下图表示限制酶切割某、下图表示限制酶切割某DNADNA的过程，从图中可知，该限制酶识别的的过程，从图中可知，该限制酶识别的碱基序列，及切割位点是碱基序列，及切割位点是 A.5-CTTAAG-3 A.5-CTTAAG-3，切点在，切点在C C和和T T之间之间 B.5-CTTAAG-3 B.

16、5-CTTAAG-3，切点在，切点在G G和和A A之间之间 C.5-GAATTC-3 C.5-GAATTC-3，切点在，切点在G G和和A A之间之间 D.5-CTTAAC-3 D.5-CTTAAC-3，切点在，切点在C C和和T T之间之间C C练习练习2 2、下面哪项不具有限制酶识别序列的特征、下面哪项不具有限制酶识别序列的特征 A A.GAATTC GAATTC B B.GGGGCCCC GGGGCCCC CTTAAG CTTAAG CCCCGGGGCCCCGGGG C C.CTGCAG CTGCAG D D.CTAAATCCTAAATC GACGTC GACGTC GATTTAGGA

17、TTTAGD D3.3.在在DNA DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNADNA上定上定位，使其成为位，使其成为 DNA DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱限制酶图谱的构建的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶。假设有以下一项实验：用限制酶 HindHind，BamHBamH和二者的和二者的混合物分别降解一个混合物分别降解一个 4kb4kb（1kb1kb即即1 1千个碱基对）大小的线性千个碱基对）大小的线性DNA DNA 分子，分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，

18、降解产物分开，如下图降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA DNA 分子上的限制位点数目分子上的限制位点数目是以下哪一组？是以下哪一组？A.Hind1 A.Hind1个，个，BamH2 BamH2 个个 B.Hind2 B.Hind2个，个，BamH3BamH3个个 C.Hind2 C.Hind2个，个，BamH1 BamH1 个个 D.Hind D.Hind和和BamHBamH各有各有2 2 个个A A练习练习0202DNA连接酶“分子缝合针”CGGCCGTATAATATGCGCGCTA

19、ATCGTATAATATGCTATAEcoR IEcoR ICGGCCGT TAAAAT TGCGCGCTAATCGT TAAAAT TGCTATACGGCCGT T A AA A T TGCTATA生物生物生物生物A A A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B B B基因片段基因片段基因片段基因片段将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNADNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNADNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合三、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合

20、针”1.1.作用作用：将双链将双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，起来，恢复恢复被限制酶切开的两个被限制酶切开的两个核苷酸之间的核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。注意：注意：不是连接氢键不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）（氢键的形成不需要酶的催化）2.2.种类种类：类型类型E.coliE.coli DNA DNA连接酶连接酶T4T4 DNADNA连接酶连接酶来源来源功能功能只缝合只缝合_ 缝合缝合_和和_结果结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体噬菌体黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键三

21、、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，（1 1 1 1）Ecoli DNAEcoli DNAEcoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T T T4 4 4 4DNADNADNADNA连接酶连接黏性末端连接酶连接黏性末端连接酶连接黏性末端连接酶连接黏性末端即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键三、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”（2 2）T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶连接平末端，效率低连接平末端，效率低三

22、、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”GAGTATCDNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATTDNA连接酶：连接两个DNA片段CAATTDNA聚合酶DNA聚合酶：以DNA的一条链作为模板，连接游离的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键。思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNADNA连接连接酶、酶、限制酶、限制酶、DNA DNA聚合酶、解旋酶、聚合酶、解旋酶、DNADNA酶的比较酶的比较项目项目 DNADNA连连接酶接酶限制酶限制酶DNADNA聚聚合酶合酶解旋酶解旋酶DNADNA酶酶作用作用部位部位作用作用对象对象作用作用结果结果磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA

23、片片段水解为段水解为单个脱氧单个脱氧核苷酸核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键 磷酸二酯键磷酸二酯键 磷酸二酯键磷酸二酯键氢键氢键DNADNA片段片段DNADNA单个的脱氧单个的脱氧核苷酸核苷酸DNADNADNADNA将两个将两个DNADNA片段片段连接成连接成完整的完整的DNADNA分子分子切割双链切割双链DNADNA分子分子将将单个的脱单个的脱氧核苷酸氧核苷酸连连接到接到DNADNA单单链末端链末端将双链将双链DNADNA分子局部分子局部解旋解旋为单为单链链三、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”限制酶解旋酶DNA连接酶DNA聚合酶RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_B.连接a处的酶

24、为_C.切断b处的酶为_a：磷酸二酯键；b：氢键练一练：根据所学知识，完成以下填空你能用你能用DNADNA连接酶将他们连接起来吗？连接酶将他们连接起来吗？2 2和和 3 3和和 ；1 1和和 ；4 4和和 。7 76 65 58 8旋转旋转180180度度判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转将其中一个末端旋转180180度度，若与另一个完全相同，则说明两个末端可能是用同一种限制酶切割，若与另一个完全相同，则说明两个末端可能是用同一种限制酶切割三、三、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”4 4、限制酶和、限制酶

25、和DNADNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是 A.DNA A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键键 B.B.限制酶只能切割双链限制酶只能切割双链DNADNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C.C.E.coli E.coli DNADNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 D.D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以原核生物中的限制限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以原核生物中的

26、限制酶也能剪切自身的酶也能剪切自身的DNADNA练习练习B B 5 5、下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是 A.A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性 B.B.限制酶只能识别和切割限制酶只能识别和切割DNADNA，不能识别，不能识别RNARNA C.C.限制酶与限制酶与DNADNA连接酶的作用部位不相同连接酶的作用部位不相同 D.D.限制酶只能从原核生物中提取限制酶只能从原核生物中提取B B6 6、如图为、如图为DNADNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依

27、分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、次表示限制性内切核酸酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、解旋酶连接酶、解旋酶作用的正确顺序是作用的正确顺序是 A A.B B.C C.D D.C C练习练习C C A.A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的 B.B.甲甲、乙乙具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端，可可形形成成重重组组DNADNA分分子子，但但甲甲、丙不能丙不能 C.DNA C.DNA连接酶的作用位点是连接酶的作用位点是b b处处 D.D.切切割割产产生生甲甲的的限限制制酶酶不不能能识识别

28、别由由甲甲、乙乙黏黏性性末末端端形形成成的的重组重组DNADNA分子片段分子片段7 7、下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是练习练习0303基因进入受体细胞的载体“分子运输车”1.1.载体的作用是什么？载体的作用是什么？2.2.有哪些种类？有哪些种类？3 3.常用的载体是哪种？其有什么特征？常用的载体是哪种？其有什么特征？4 4.作为载体应具备什么条件？作为载体应具备什么条件？三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”作为运载工具，将外源基因送入受体细胞质粒、噬菌体和动植物病毒质粒将将 送入受体细胞，送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行在受体细

29、胞内对目的基因进行大量复制大量复制。外源基因在基因工程中使用的载体包括在基因工程中使用的载体包括 等。等。质粒、噬菌体和动植物病毒三、三、基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”1.1.作用作用：2.2.种类种类：3.3.最常用的载体最常用的载体质粒质粒 一种一种裸露裸露的的、结构简单、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核拟核DNADNA之之外外，并并具有自我复制能力的环状双链具有自我复制能力的环状双链DNADNA分子分子。终止子：终止子：转录的转录的终点，在转录过终点，在转录过程中起调控作用。程中起调控作用。启动子启动子:转

30、录的转录的起点，在转录过起点，在转录过程中起调控作用。程中起调控作用。复制原点复制原点:DNADNA复制的起始位点。复制的起始位点。标记基因标记基因其基因属于细胞质基因。其基因属于细胞质基因。四、基因进入受体细胞的载体四、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”4.4.运载体运载体需具备的条件：需具备的条件：在受体细胞中稳定存在并能在受体细胞中稳定存在并能自我复制自我复制 或或整合到受体整合到受体DNADNA上，随受体上，随受体DNADNA同同 步复制步复制；有有一个至多个限制酶一个至多个限制酶切割位点，切割位点，便于插入（携带）目的基因；便于插入（携带）目的基因；具有具有标记基因标记基

31、因，便于，便于筛选筛选含有含有重组重组DNADNA分子的细胞；分子的细胞；对受体细胞对受体细胞无害无害、易分离。、易分离。真正被用作载体的质粒，真正被用作载体的质粒，都是都是在天然质粒的基础在天然质粒的基础上进行过人工改造的。上进行过人工改造的。四、基因进入受体细胞的载体四、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”知识拓展知识拓展标记基因通常有标记基因通常有:抗生素的抗性基因抗生素的抗性基因，如，如:抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因(amp(ampr r)、抗四环素基因抗四环素基因(tet(tetr r)荧光蛋白基因荧光蛋白基因，如，如:绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(GFP)(GFP

32、)、红、红色荧光蛋白基因色荧光蛋白基因(RFP)(RFP)载体上的载体上的标记基因标记基因一般是一般是某种抗生素的抗性基因某种抗生素的抗性基因，而，而受体细胞没有抵受体细胞没有抵抗该抗生素的能力抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体携带目的基因导入受将含有某抗生素抗性基因的载体携带目的基因导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。受体细胞对该抗生素产生抗性。在在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。目的基因是一个目的基因是一个DNADNA片段，不

33、含有复制原点、片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。不含有启动子和终止子。3.3.为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？1.1.质粒上质粒上有一个或多个限制酶切点，有什么作用有一个或多个限制酶切点，有什么作用？思考：思考：大肠杆菌及质粒结构模式图大肠杆菌及质粒结构模式图供外源基因或外源供外源基因或外源DNADNA片段插入其中。片段插入其中。2.2.质粒上质粒上有标记基因，有什么作用有标记基因，有什么作用？便于重组便于重组DNADNA的筛选、鉴定和选择。的筛选、鉴定和选择。目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。目的基因不能自主复制，不能稳定存

34、在并遗传给后代。四、基因进入受体细胞的载体四、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”限制酶的选择限制酶的选择1.1.酶切位点要保证酶切位点要保证目的基因目的基因是完整的是完整的2.2.酶切位点要要位于启动子和终止子之间（启动子下游）酶切位点要要位于启动子和终止子之间（启动子下游）1111、用限制酶用限制酶EcoREcoR单独切割某质粒，可产生单独切割某质粒，可产生1 1个个14 kb(1 kb14 kb(1 kb即即1 0001 000个碱个碱 基对基对)的长链，而同时用限制酶的长链，而同时用限制酶EcoEcoRR、MboMbo联合切割该质粒，可得到联合切割该质粒，可得到 三种长度的三

35、种长度的DNADNA片段，见下图片段，见下图(其中其中*表示表示EcoEcoR R 切割后的一个黏性末端切割后的一个黏性末端)。若用若用MboMbo单独切割该质粒，则产生的单独切割该质粒，则产生的DNADNA片段的长度为片段的长度为 A.2.5 kb A.2.5 kb和和5.5 kb 5.5 kb B.2.5 kbB.2.5 kb和和6 kb6 kb C.5.5 kb C.5.5 kb和和8 kb 8 kb D.6 kbD.6 kb和和8 kb8 kbD D练习练习限制酶DNA连接酶载体对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体

36、、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来课堂小结课堂小结提取生物大分子的基本思路：提取生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学方法物理或化学方法，分离具有不同，分离具有不同物理或化学性质物理或化学性质的生物大的生物大分子。分子。五、五、DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.1.实验原理实验原理 利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差在物理和化学性质方面的差异异，提取，提取DNADNA，去除其他成分。，去除其他成分。DNADNA不溶于酒精，不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精DNADNA能溶于物质的量浓度为能溶于物质的量浓度为2 mol/L2 mol/L的的NaClNaCl溶液溶液在一定温度下，在一定温度下，DNADNA被二苯胺试剂染成蓝色被二苯胺试剂染成蓝色初步分离初步分离DNADNA和蛋白质和蛋白质溶解溶解DNADNA鉴定鉴定DNADNA五、五、DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定