生物 5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 新人教版选修1.ppt

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1、课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段【课题背景课题背景】在刑事侦破案件中常需要对样品在刑事侦破案件中常需要对样品DNADNA进行分析，进行分析，PCRPCR技术能快速扩增技术能快速扩增DNADNA片段，在几个小时内复制出上百万份的片段，在几个小时内复制出上百万份的DNADNA拷贝，有效地解决了因拷贝，有效地解决了因为样品中为样品中DNADNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCRPCR技技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆

2、和基因测序。因测序。【课题目标课题目标】1.1.理解理解PCRPCR的原理和反应过程的原理和反应过程2.2.尝试尝试PCRPCR技术的基本操作技术的基本操作3.3.讨论讨论PCRPCR技术的应用技术的应用PCRPCR仪仪 以“DNA复制”为背景材料，设计问题，导入新课，首先回顾DNA的结构和复制的有关知识，然后了解PCR技术的原理和应用，接着讲解PCR技术的反应过程及具体实验操作步骤，后以视频观看来再次学习实验的知识点。最后通过课堂检测完善所学内容。通过对PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性、延伸；每

3、一步骤的作用。在教学中分析图形的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物1.1.胞内胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系一、基础知识一、基础知识打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸(一）一）PCRPCR原理原理2.DNA2.DNA双链方向与复制

4、关系双链方向与复制关系（2 2）DNADNA聚合酶只能从聚合酶只能从3 3 端延伸端延伸DNADNA链，故链，故DNADNA复制需要引物。复制需要引物。（1 1）DNADNA的羟基的羟基“OHOH”末端称为末端称为3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5端。端。DNADNA合成总是从子链的合成总是从子链的5 5 端向端向3 3 端伸端伸3 3 端端5 5 端端3.PCR3.PCR原理原理（1 1）DNADNA的热变性原理的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合通过控制温度来控制双链的解聚与结合变性：变性：8080100100C C的温度范围内，的温度范围内，DNADN

5、A双螺旋结构解体，双链分开双螺旋结构解体，双链分开加热变性加热变性复性：复性：温度缓慢降低后，两条彼此分离的温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链重新结合成双链链重新结合成双链缓慢冷却复性缓慢冷却复性（2 2）耐高温的）耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶（3 3）缓冲液为）缓冲液为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质 DNADNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的耐热的DNADNA聚合酶，同时通过控制温度使聚合酶，同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行【方法点

6、拨方法点拨】细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA单链，其长度通单链，其长度通常为常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的来实现的 （二）（二）PCRPCR的反应过程的反应过程PCRPCR一般要经历三十多次循环，每次循环分为一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸变性、复性和延伸三步三步(1)(1)变性变性温度上升到温度上升到9

7、0 90 以上时，双链以上时，双链DNADNA解旋为单链。解旋为单链。(2)(2)复性复性温度下降到温度下降到50 50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链链DNADNA结合。结合。温温度度上上升升到到72 72 左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸(A(A、T T、C C、G)G)在在DNADNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链。链。(3)(3)延伸延伸【方法点拨方法点拨】(1)72(1)72 左右时，左右时，TaqDNATaqDNA聚合酶有最大活性，可使聚合酶

8、有最大活性，可使DNADNA新链由新链由55端向端向33端延伸。端延伸。(2)DNA(2)DNA聚聚合合酶酶只只能能特特异异性性地地复复制制处处于于两两个个引引物物之之间间的的DNADNA序序列列，使使该该段固定长度的序列呈段固定长度的序列呈“指数式指数式”扩增。扩增。标准的标准的PCRPCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是的温度依次是()A A92 92、50 50、72 72 B B72 72、50 50、92 92 C C50 50、92 92、72 D72 D80 80、50 50、72 72 栏目链接【典型例

9、题典型例题】A A【方法点拨方法点拨】1.1.变性：变性：温度上升到温度上升到90(9090(9096)96)以上时，双链以上时，双链DNADNA解旋为单链解旋为单链2.2.复性：复性：温度下降到温度下降到50(4050(4060)60)左右时，两种引物通过碱基左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链互补配对与两条单链DNADNA结合结合3.3.延伸：延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸溶液中的四种脱氧核苷酸(A(A、T T、C C、G)G)在在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链链二、实验操作二、实验操作

10、1.PCR1.PCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具一台能够一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2.2.微量离心管微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容，总容积为积为0.5ml0.5ml3.3.微量移液器微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头用其上的一次性吸液枪头用一次更换一次一次更换一次1.1.准备准备2.2.移液移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微

11、量离心管里面加反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。入各种试剂。3.3.混合混合过程：过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意注意:A.A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。B.B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。4.4.离心离心过程：过程：将微量离心管放在离心机上将微量离心管放在离心机上,离心约离心约10s10s。目的：目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。使反应液体集中在离心管底

12、部，提高反应效果。循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第一次第一次9494C C，10min10min3030次次44，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min5.5.反应反应将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环程序。仪的循环程序。【注意事项注意事项】避免外源避免外源DNADNA等因素的污染等因素的污染隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；用必须进行高压

13、灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。在在PCRPCR实验操作中，下列说法不正确的是实验操作中，下列说法不正确的是()A A在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B B离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢C C用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D D离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果变 式训 练 栏目链接【典型例题典型例题】A A3.3.离心离心10s10s的

14、目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。【方法点拨方法点拨】1.1.在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；2.2.离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n

15、n次，次，DNADNA为为a a 2 2n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关三、课题成果评价三、课题成果评价2.2.过程过程稀释稀释 2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样品进行蒸馏水，即将样品进行5050倍稀释倍稀释对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在

16、波长260nm260nm处，将紫外分光光度处，将紫外分光光度计的读数调节至零计的读数调节至零计算计算 取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的光吸收值处的光吸收值计算计算DNADNA含量（含量（g g）50 x(260nm50 x(260nm的读数）的读数）x x 稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/mL/mL的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为0.020.02紫外分光度计紫外分光度计比色杯比色杯四、四、课题延伸课题延伸PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增

17、技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、它具有特异、敏感、产率高、敏感、产率高、快速、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点简便、重复性好、易自动化等突出特点 例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环扩增量达轮循环扩增量达2 23030个拷个拷贝（贝（10109 9拷贝）拷贝）【课堂小结课堂小结】一、一、PCRPCR原理原理1.1.变性：变性：温度上升到温度上升到90(9090(9096)96)以上时，双链以上时，双链DNADNA解旋为单链解旋为单链2.2.复性：复性：温度下降到温度下降到50(4050(4060)60)左右时，两种引物

18、通过碱基左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链互补配对与两条单链DNADNA结合结合3.3.延伸：延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸溶液中的四种脱氧核苷酸(A(A、T T、C C、G)G)在在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链链二、二、PCRPCR操作操作1.1.准备准备2.2.移液移液3.3.混合混合4.4.离心离心5.5.反应反应PCRPCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNADNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（复制过程相比，主要有两点不同，它们是（）PCRPCR过程需要的引物是人工合成的单

19、链过程需要的引物是人工合成的单链DNADNA或或RNARNAPCRPCR过程不需要过程不需要DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的现的PCRPCR过程中，过程中，DNADNA不需要解旋，直接以双链不需要解旋，直接以双链DNADNA为模板进行复制为模板进行复制A A B B C C D D【课堂练习课堂练习】C C【方法点拨方法点拨】1.PCR1.PCR过程需要耐高温的过程需要耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶2.PCR2.PCR过程中，过程中，DNADNA不依靠解旋酶解旋，而是利用高温解旋，然后以单不依靠解旋酶解旋，而是利用高温解旋，然后以单链链DNADNA为模板进行复制为模板进行复制