凝胶过滤层析 .ppt

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1、橡顾谤呵棉业稠巫适纳薪刮耻饼认巢静四龙猾皋爽擒宪只绷漳窍如灸蛹晓凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC遏窜旅踪访兹搽捍界叛擒踢亿杉遁宪恋奎帮户寄拨昼心锥俱芍烙端务提迷凝胶过滤层析凝胶过滤层析定义n n凝胶过滤层析是生化分离常用凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术色谱技术的一种。的一种。n n利用具有网状结构的凝胶的利用具有网状结构的凝胶的分子筛分子筛作用作用,根据被分离根据被分离物质的物质的分子大小不同分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻来进行分离，也被称为体积排阻层析（层析（size exclusion chromatogra

2、physize exclusion chromatography）、分子筛）、分子筛层析（层析（Molecular Sieve ChromatographyMolecular Sieve Chromatography）、凝胶渗）、凝胶渗透层析（透层析（Gel Permeation ChromatographyGel Permeation Chromatography）锹梆兰废挛赋七爽泻荐花醉叙姓采桔右泌旺轴瘪拱敬窒屋碧孔合井闭密沥凝胶过滤层析凝胶过滤层析应用l l凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。l l分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完

3、全将它们分开。l l利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。底激法狂卉沂杨馁泳腥矿咕糊关匀啡链瓣赠监翰剁添试缮税选使烬未央阵凝胶过滤层析凝胶过滤层析原理n n凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。个颗粒犹如一个筛子。n n当样品溶液通过凝胶柱时，当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子相对分子质量较大质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；n n相对分子质量较小相对分子质量较小的物质可自由地进的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移出凝胶颗粒

4、的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。动速率慢而最后流出层析柱。n n中等大小的分子中等大小的分子在大分子物质与小分在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。子物质之间被洗脱。n n这样，经过层析柱，混合物中的各物这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。质按其分子大小不同而被分离。带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出潦败袖跳艾冻滔人解瘴停侨歧瘤藩烟夯己校网玩躲阉硼烤赢宜登邑拨魂析凝胶过滤层析凝胶过滤层析固定相（凝胶）固定相（凝胶）n三维空间网状结构三维空间网状结构

5、样品样品样品样品固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较快流出较快流出分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应：按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同按分子大小不同,在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用阻滞作用阻滞作用阻滞作用有差异有差异有差异有差异,从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。胶柱中的迁移速度不同得到分离。胶柱中的迁移速度不同得到分离。胶柱中的迁移速度不同得到分离。汇帐防杉症牺音仟纲篷糕入钓蓝粥声锥垃莫圣首讹摊劈作燕乎俗串蓟匀郊凝胶过滤层析凝胶过滤层析基本概念n

6、 n外水体积外水体积外水体积外水体积(Vo)(Vo)(Vo)(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。间液体流动相的体积。间液体流动相的体积。间液体流动相的体积。n n内水体积内水体积内水体积内水体积(Vi)(Vi)(Vi)(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。是指凝胶颗粒中孔穴的体积。是指凝胶颗粒中孔穴的体积。是指凝胶颗粒中孔穴的体积。n n基质体积基质体积基质体积基质体积(Vg)(Vg)(Vg)(Vg)是指凝胶

7、颗粒实际骨架体积。是指凝胶颗粒实际骨架体积。是指凝胶颗粒实际骨架体积。是指凝胶颗粒实际骨架体积。n n柱床体积柱床体积柱床体积柱床体积(Vt)(Vt)(Vt)(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。就是指凝胶柱所能容纳的总体积。就是指凝胶柱所能容纳的总体积。就是指凝胶柱所能容纳的总体积。n n洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积(Ve)(Ve)(Ve)(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部

8、分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）眷佰绿谦瘴奋盆除舅哈悬栓骑懊夏蹈贵迈调挠挎完苔怖部蕴妨缕带槽恋贾凝胶过滤层析凝胶过滤层析分配系数（Kd）Ve=Vo+Ve=Vo+Ve=Vo+Ve=Vo+KdKdKdKdViViViVi(2)Ve=Vo+Vi(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部扩散完全向凝胶颗粒内部扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo，Kd=0Kd=0n分子完全被排阻于凝胶颗粒之外分子完全被排阻于凝胶颗粒之外n全部分布于流动相里全部分布

9、于流动相里n最先流出最先流出(3)0 Kd 1(3)0 Kd 1，Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKdn为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散散n每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数特点：特点：与被分离物质分子的与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关有关 Kd=0 0Kd=0 0Kd=0 0Kd=0 0Kd1 Kd=1Kd1 Kd=1Kd1 Kd=1Kd1 Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积小分子量小分子量大分子量大分子量靳哭怀阉这醛滚肯厢纪逻馋括系洋嘲腊灵势彬

10、锰南团洞胖谚责赤游沟儡颧凝胶过滤层析凝胶过滤层析典型的凝胶类型n交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖凝胶：SephadexSephadex n聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl Sephacryl n琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：SepharoseSepharose和和Bio-GelBio-Gel n其它：有机凝胶其它：有机凝胶SepharonSepharon，交联聚醚，交联聚醚ToyopealToyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等，纤维素凝胶，改性刚性填料等仁失觅涯伤住抵叮宰屎笨褐茶硬讹埋姨蛹泰往吞邓药啪嫉伙掷被珐颁誊胳凝胶过滤层析凝胶过滤层析葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（葡聚糖凝

11、胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephadexSephadexSephadex）具有）具有）具有）具有良好的化学稳定性，是目前生良好的化学稳定性，是目前生良好的化学稳定性，是目前生良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中化产品制备中化产品制备中化产品制备中最常用最常用最常用最常用的凝胶。的凝胶。的凝胶。的凝胶。基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖基本骨架：葡聚糖（dextrandextrandextrandextran）;交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：3-3-3-3-氯氯氯氯-1-1-1-1,2-,2-,2-,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通环氧氯丙烷使葡聚糖之间通环氧氯丙烷使葡聚糖

12、之间通环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构间网状结构间网状结构间网状结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，应条件来控制。交联度越大，应条件来控制。交联度越大，应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。网孔越小，吸水膨胀就越小。网孔越小，吸水膨胀就越小。网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小

13、，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大膨胀就越大膨胀就越大膨胀就越大Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 700 DG15 1,500G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000交联葡聚糖凝胶的化学结构交联葡聚糖凝胶的化学结构 篆夺鼠硷唁胖讽听棺御袍友磊篡尝公箍落震缮蕴锥型趁竣矛位耗管害梧皖凝胶过滤层析凝胶过滤层析葡聚糖凝胶1理化性质理化性质n葡聚糖凝胶的外观为白

14、色珠状颗粒。n它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。n由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理理化化性性质质在水中的有明显的差异：膨胀度膨胀度(床体积)吸水量吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量)筛孔的大小筛孔的大小 分级范围分级范围n葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样阎萍凸斌荫浆液就拍久哩割蓑家握鱼胎韧他壳弱氛矗虐竖锤牲苗剧求招淳凝胶过滤层析凝胶过滤层析分类n以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水水溶溶性性物物质质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶过滤过滤层析层析。n以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或

15、N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有有机机溶溶剂剂为流动相，对脂脂溶溶性性物物质质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶渗透渗透层析层析。侮咎涌欣宛词栅梭简竞厕肖遗届垮哟豁盼屑藤牟回起粒戍洲恳猾拙切住铡凝胶过滤层析凝胶过滤层析2稳定性稳定性 n葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。n在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)消毒0.5h，其性质并不改变。n在0.1molL HCl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。n当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使

16、糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。n葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不然微生物将生长。瞩东么保甸误康拢战邓味需氖南痰刃购揉丝攀御内吻丸艺漆蚁圭撑钎陶鉴凝胶过滤层析凝胶过滤层析3吸附性吸附性 n n葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶系系弱弱酸酸性性物物质质，这这是是由由于于其其每每克克干干胶胶中中含含10-20g10-20g当量的当量的羧基基团羧基基团所致。所致。n n羧羧基基基基团团能能与与分分离离物物中中电电荷荷基基团团 (尤尤其其是是碱碱性性蛋蛋白白质质)发生发生吸附吸附作用作用。n n这这种种吸吸附附作作用用可可以以借借助助提提高高洗洗脱脱液

17、液的的离离子子强强度度得得以以克克服。服。当当离离子子强强度度大大于于0.050.05时时，一一般般对对弱弱碱碱性性蛋蛋白白质质就就无无吸附力吸附力了。了。因此，常用含有因此，常用含有NaClNaCl的缓冲液的缓冲液作作洗脱液洗脱液。逗瑟入稼毋祈檀矮嚏犬束社彬墙臀屠勺孪诬定郭辕丈棒客禁毡悍弱虫涪蛹凝胶过滤层析凝胶过滤层析琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)n n琼脂糖是从琼脂糖是从琼脂琼脂中分离出来的。中分离出来的。n n在在制制备备过过程程要要将将其其中中含含硫硫酸酸根根和和羧羧基基基基团团的的琼琼脂脂胶胶除除去，得到不带电荷基团的去，得到不带电荷基团的琼脂糖琼脂糖。n n琼琼脂脂糖糖是

18、是由由D-D-半半乳乳糖糖和和3 3、6 6脱脱水水的的L-L-半半乳乳糖糖连连接接构构成成的的多糖链多糖链。n n这这种种多多糖糖链链在在100100左左右右时时呈呈液液态态，当当温温度度下下降降到到4545以下以下时呈固态。时呈固态。n n它它们们之之间间以以氢氢键键方方式式相相互互连连接接就就成成了了线线性性的的双双链链单单环环的琼脂糖，经凝聚即的琼脂糖，经凝聚即呈束状呈束状的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。们俭君才帐皑奢铁喷恭奴钧钵录亲史贪闻洞芭蜘肪翰钨越蘑拎荒猜谢蔫新凝胶过滤层析凝胶过滤层析n n该该物物质质对对尿尿素素和和盐盐酸酸胍胍等等破破坏坏氢氢键键的的试试剂剂有有较较强强的的抵抵抗

19、力，在抗力，在pH4.0-9.0pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。的缓冲液中是稳定的。n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶室室温温保保存存，其其物物理理稳稳定定性性超超过过了了聚聚丙丙烯烯酰酰胺和葡聚糖凝胶。胺和葡聚糖凝胶。n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶在在干干燥燥状状态态下下保保存存时时易易破破裂裂，故故一一般般存存放放在在含防腐剂的水溶液含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。中，同时还要避免剧烈的搅动。n n琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶按按按按其其其其浓浓浓浓度度度度来来分分有有Sepharose Sepharose 2B(22B(2)、4B4B(4(4)和和6B(66B(6)。Sepharose S

20、epharose 6B6B的的机机械械强强度度大大于于2B2B，但但是是筛筛孔孔小小于于2B2B。值樊窝建怯凿跋胸雁怨店浪嫉殷魄拥糙枫贵刁岛酒赫脯澄孕弛恫绣延赏疟凝胶过滤层析凝胶过滤层析n琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些流速可以快些。n大孔凝胶，大孔凝胶，工作范围的下限几乎是工作范围的下限几乎是 Sephadex Sephadex的上限的上限n可分离可分离MW40MW40万以上万以上的物质的物质n可用来分离核酸及病毒可用来分离核酸及病毒梳善吉禁匹打馈风足惜哪邓隆有必惯筒妥灶旋爹榨眉享浓捧颂屎瞥战革札凝胶过滤层析凝胶过滤层析三、聚丙烯酰胺

21、凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶n聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。n它是以甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺(双体)作交交联联剂剂，以过硫酸铵硫酸铵作催化剂，在N,N,N,N,-四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)加速剂的作用下，将丙烯酰胺丙烯酰胺(单体)聚合而成的。n当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。兴吹黑寻枕罩篓职龚助崩坠耐颁友渭苞工墩气鼓烛弄形龟抄饮胀吗岁乾蝗凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择2 2、凝胶的预处理、凝胶的预处理3 3、装柱、装柱4 4、样品的准备、样品的准备5 5、上样、上样6 6、洗脱和收集、洗脱和收集7 7、凝胶的再生及保存

22、、凝胶的再生及保存凄氧蹬靛灯赴泉油亚翱伶哈遣吾趋各意器萧淖悼吩度有殷盼煌蓬鲤鉴伤刀凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析实验技术1 1、凝胶的选择、凝胶的选择n选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的凝胶的分离范围分离范围（渗入限与排阻限）、（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、理化稳定性、强度、非特异吸附性质非特异吸附性质等。等。n对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式

23、。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作，如蛋白质与盐类，称作类类分离或组分离分离或组分离。另一类则是要将。另一类则是要将分子量相差不很大的物质分子量相差不很大的物质加加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离分级分离。后。后者对实验条件和操作要求都比较高。者对实验条件和操作要求都比较高。避判痒总模踢粳腿视锚凛捆拌评议将吃仰凭删锨瑞汉戳春单沙啄肝莽巨戌凝胶过滤层析凝胶过滤层析类分离n目的是分开样品中分子量悬殊的目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组较大分子组”和和“较小分子组较小分子组”两类物质

24、，并不要求分离分子量相近的组分两类物质，并不要求分离分子量相近的组分n选择凝胶时，应使样品中选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限大分子组的分子量大于其排阻限，而，而小小分子组的分子量小于渗入限分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数。也就是说大分子的分配系数Kd=0Kd=0，小分子的小分子的KdKd1 1。这样能取得最好的分离效果。这样能取得最好的分离效果。例题：从某蛋白质溶液（例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下列）中除去无机盐，应选择下列哪种凝胶最合适？哪种凝胶最合适？B.Sephadex G-25（分级范围，（分级范围，1000-5000

25、 D）A.Sephadex G-15（分级范围，（分级范围，1,500 D）C.Sephadex G-150（分级范围，（分级范围，5,000-400,000 D）速祁伙伊颖虎弊墟实关杉迈剖抬凶之锐掇袒埠离锻欲聚绥拉赖磁掂吼惦木凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶粒度的影响n凝胶粒度的大小凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒细粒凝胶柱凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析精制分离或分析等。等。粗粒粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱

26、盐粗制分离，脱盐等。等。n在一般柱层析中，使用干颗粒直径在在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m70m左右较合适。对于在水中左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m150m左右。凝胶颗粒大小左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的同一流速下不同粒度的Sephadex G-25Sephadex G-25柱的洗脱效果柱的洗脱效果腐辣蜡泵尔佛叠百波咖额膛烷模钡第吼烘瞥赣踏咨焙弓蔬违浪蹬粒凛伞进凝胶过滤层析凝胶过滤层析2、凝胶的预处理n溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时

27、以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量n平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）周漓审沃柞握暂踢蒋翼凛插企殆狙芦向忍儒碾氛衡给唁摈烹始泳漆归晤吠凝胶过滤层析凝胶过滤层析3、装柱n n一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高50cm50cm50cm50cm比较合适；分级分离时，比较合

28、适；分级分离时，比较合适；分级分离时，比较合适；分级分离时，100cm100cm100cm100cm较为合适较为合适较为合适较为合适n n具体步骤为：具体步骤为：具体步骤为：具体步骤为：l l将层析柱将层析柱将层析柱将层析柱垂直固定垂直固定垂直固定垂直固定，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约，一般是先在柱内装入约1/31/31/31/3高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液高度的水或缓冲液排走空排走空排走空排走空气气气气；l l将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中

29、，待其自然沉降至将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/31/4-1/31/4-1/31/4-1/3高时打开高时打开高时打开高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。l l用用用用3-53-53-53-5倍柱床体积的倍柱床体积的倍柱床体积的倍柱床体积的起始缓冲液起始缓冲液起始缓冲液起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分走柱，使凝胶介质充分平衡平衡平衡平衡，

30、柱床稳定，柱床稳定，柱床稳定，柱床稳定（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。（若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。层析柱层析柱（a a）自自制制简简易易层层祈祈柱柱（1 1玻玻璃璃管；管；2.2.橡皮塞；橡皮塞；3 3尼龙网）；尼龙网）；（b b）普通商品柱；）普通商品柱；（c c）双双底底板板层层析析柱柱（1.1.洗洗脱脱液液进进出出口口；2.2.多多孔孔底底板板；3 3柱柱床床；4 4恒恒温温水水进进口口；5 5恒恒温温水水出出口口；6 6可调节的塞子）可调节的塞子）幂违备操骚婶棵嫩逼运诌孪

31、缀喻苗甭娟缸鹅孰淫蹲漱沾粉兔早念泛茶井呆凝胶过滤层析凝胶过滤层析4、样品的准备p样品的样品的粘度粘度：粘度大产生介质吸附，：粘度大产生介质吸附，一般要求样品粘度一般要求样品粘度小于小于0.01Pas0.01Pasp样品的样品的浓度浓度：样品浓度以：样品浓度以不大于不大于4 4为宜，样品浓度过大往往导致粘为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱或离心除去颗粒后上柱p样品的样品的体积体积：分析用量一般应：分析用量一般应低于低于总柱体积的总柱体积的5%5%，制备用量一般为，制备用量一般为15%15%或更多（或更多（20-30%20-

32、30%）。样品黏度对洗脱曲线的影响（1 1）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为5%5%，相对粘度，相对粘度11.8;11.8;（2 2）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为2.5%2.5%，相对，相对粘度粘度4.2;4.2;（3 3）加葡萄糖）加葡萄糖2 0002 000，使终浓度为，使终浓度为1%.1%.被馁儿路同扦皿瑶踞婉稗邻荒眶亡龄谢拍吕狈断呻锻浇璃肋抗夷仰缄胖庙凝胶过滤层析凝胶过滤层析5、上样p具体步骤为：p打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶胶面p沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少

33、量起始缓冲液洗涤柱壁p加样时应尽量减少凝胶床面的搅动。加样的方法可以是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制蓑傅剿蘑尚艘败另博拎拈颊腊耪昂素邦醇公座拍磅屏敬滦退搭荐胚邪喳澳凝胶过滤层析凝胶过滤层析6、洗脱和收集n打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。n用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。p洗脱时应注意的问题洗脱时应注意的问题：流速不宜过快且要稳定流速不宜过快且要稳定洗脱液的成分也不应改变洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度）（凝胶溶胀程度）整个洗脱过程中始终保持一定的操作压整个洗脱过程中始终保持一定的操作压

34、可以用水或缓冲液作洗脱液可以用水或缓冲液作洗脱液 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 流速较低，分辨率较高流速较低，分辨率较高常常常常用用用用恒恒恒恒流流流流泵泵泵泵控控控控制制制制蝎某暖迄此喘紊拽锌承欧虏某拓柬匙枯乘邪司株洁吮冬叔咀酉颜衫士傈山凝胶过滤层析凝胶过滤层析7、凝胶的再生及保存p再生p 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能，或参照凝胶产品说明书p凝胶的保存方法p 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷居潍皆很申歧噪昧臂宰料腆幸形寐渣丹及昆犀面诈炸蜀铱魂钵因羊检烷导凝胶过滤层析凝胶过滤层析应用：测定相对分子质量p标准曲线法标准曲线法 对于对于

35、特定的测定系统特定的测定系统，先以，先以3 3个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白个以上（越多越好）的已知分子量的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的VeVe值。以值。以VeVe作纵作纵坐标，坐标，LogMLogM作横坐标制做标准曲线。作横坐标制做标准曲线。在在同一测定系统同一测定系统中测出未知物质的中测出未知物质的VeVe值便可由标准曲线求得分子量。分子量值便可由标准曲线求得分子量。分子量在在10 00010 000150 000150 000之间的球形蛋白用此法测出的分子量误差在之间的球形蛋白用此法测出的分子量

36、误差在1010左右左右Velog M标准曲线标准曲线幼锐每轧央炽期斟寅砂铂渊肥皆忘裤绒该蚂居兰展之嫉兆贞迭歌室圣茁跪凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点p优点：p操作条件温和，样品回收率可接近100，并且重复性高。p作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；p分离机理简单，操作参数少，容易规模放大p缺点：p分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离p料液处理量小，并且样品粘度不宜太高p分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，流速过快会降低分辨率琅傣孔骇签伍忿搐但缺辟栖了贴悼扭钵易逼新俭弗甘恰儡泽艇央型鸣揖展凝胶过滤层析凝胶过滤层析佩太嫌板缓野垦俐逾畔肋积恭握贼谩怔奈掏阁刹峭高拷参脖纤洋伶忆鲜星凝胶过滤层析凝胶过滤层析