大肠杆菌的培养和分离 .ppt

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1、微生物微生物(microorganism)l结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。细胞结构的低等生物。l例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等原生动物等等微生物的利用：微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理抗生素；酒；腐乳；污水治理大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离一、大肠杆菌（一、大肠杆菌（E.coli）兼性厌氧的肠道内的共生菌群兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素合成维生素B B和维生素和维生素K K，供机体利用；，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和产生大肠

2、杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。腐生菌滋生。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌作为一种工程菌，作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病的药物例：大规模生产治疗糖尿病的药物胰岛素胰岛素培养基（培养基（culture media）按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件提供微生物生长的条件：合适的温度：合适的温度：25-3725-37合适的合适的pHpH：细菌：细菌 6.5-7.5 6.5-7.5 中性偏碱中性偏碱 真菌真菌 5.0-6.0

3、5.0-6.0 中性偏酸中性偏酸营养成分：营养成分：含有含有碳源、氮源、生长因子、水和无碳源、氮源、生长因子、水和无机盐机盐。细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素培养基内所需的其他条件培养基内所需的其他条件n(1)pH值值n如如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性性n(2)特殊营养物质特殊营养物质n如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素素n(3)氧气的含量氧气的含量n如如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件LB培养基的配方培养基的配方培养基成分培养基成分各成分的量各成分的量蛋白胨蛋

4、白胨0.5g酵母提取物酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至加至50ml固体培养基的配制：每固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加液体培养基添加1g 琼脂琼脂琼脂？琼脂？红藻中提取的多糖红藻中提取的多糖,在在98 以上熔化，以上熔化，44 以以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂凝固剂固体培养基：菌落固体培养基：菌落n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的形态结构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落是菌落是鉴定菌种

5、鉴定菌种的重要依据。的重要依据。菌落菌落 液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长(三三)无菌技术无菌技术l1、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键:l2、无菌技术、无菌技术 的的四个方面四个方面(参看教材参看教材20页页)l3、消毒与灭菌、消毒与灭菌防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵无菌技术的四个方面无菌技术的四个方面l（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒行清洁和消毒；l（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌进行灭菌；l（3）为避免周围微生物污染，

6、实验操作应在）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；酒精灯火焰附近旁进行；l（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。相接触。（1 1）消毒：）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。物的过程。消毒与灭菌消毒与灭菌（2 2）灭菌：）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。普通也是最重要的技术。以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微生物，包括微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到所有细菌的繁殖体、芽

7、孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌的过程。的过程。1)消毒：消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？微生物。包括芽孢和孢子吗？方法方法:a.煮沸消毒法煮沸消毒法b.巴氏消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒如牛奶的消毒c.化学药剂消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等皂溶液等d.紫外线消毒紫外线消毒(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)（2）灭菌）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生概念：使用强烈的理化因素杀死物体内

8、外所有的微生物，包括芽孢和孢子。物，包括芽孢和孢子。方法：方法：a 灼烧灭菌灼烧灭菌 b 干热灭菌干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌a.灼烧灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具微生物的接种工具(接接种环、接种针种环、接种针)或其或其他金属用具直接在火他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围注意适用范围b.干热灭菌干热灭菌 160170；12h能耐高温的需要保持干能耐高温的需要保持干燥的物品燥的物品(玻璃器皿玻璃器皿)c.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min通常用于培养基的灭菌通常用于培养基的灭菌高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法为湿热

9、灭菌法，其优点有三：高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：1 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性；、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性；2 2、湿热穿透力强；、湿热穿透力强；3 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。果，因此，它是效果最好的灭菌方法。2.2.请你判断以下材料或用具是否需要请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的

10、双手实验操作者的双手答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。1二、大肠杆菌的培养和分离实验操作二、大肠杆菌的培养和分离实验操作 （一）培养基的配置与灭菌（一）培养基的配置与灭菌 取取2个个250ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养液体培养基和基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基液体培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体培养基固体培养基细菌的划线分离细菌的划线分离封口膜：既通气封口膜：既通气

11、又不使菌进入又不使菌进入 （二）倒平板（二）倒平板 灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后个培养皿中，倒后立即置于立即置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面待凝，使之形成平面培养皿壁上培养皿壁上不能沾有培不能沾有培养液，否则养液，否则容易污染。容易污染。注意事项：注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用

12、酒精棉球消毒菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三另外三指持三角瓶角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养（三）大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大肠杆

13、菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法平板划线分离法平板划线分离法平板划线的操作平板划线的操作不能使用脱不能使用脱脂棉，否则脂棉，否则容易吸水，容易吸水，造成污染。造成污染。

14、一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。单菌落单菌落进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回在盖上；如果正放培养皿

15、，则水分形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响，菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。恒温培养时，培养皿必须倒置。划线分离法划线分离法注意事项注意事项:1.接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液,但要在培养基不但要在培养基不同位置同位置连续划线多次连续划线多次.2.划线划线首尾不能相接首尾不能相接3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1224h 1.培养基灭菌后，需要冷却到

16、50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？进行划线？答：答：以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端

17、开始划线？总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量然后取一定量稀释液加在固体培养基上稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.划线分离法和涂布分离法哪个更

18、好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。五、菌种的保存 1 1、临时保藏：、临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：、长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法课后思考题课后思考题1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。（胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染

19、概率。（原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3 3）注）注意微生物生长条件，如意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温度等。、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜细菌喜碱，喜蛋白质，喜3737度；霉菌喜酸，喜度；霉菌喜酸，喜糖，喜糖，喜25-3025-30度度2.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是

20、区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法革兰氏染色法等。等。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如成的水滴会落入

21、培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。的。4.实验完成后实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃弃物也要高压灭菌后再抛弃5.如果分离的是转基因的大肠杆菌如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的如何保证不被普通的大肠杆菌所污染大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的过改造的，通常加入了抗性基因的DNADNA序列，序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。行培养。