疟原虫的镜检技术制片染色 .ppt

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1、疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术制片与染色制片与染色主要内容主要内容v厚薄血膜的制作与染色。v疟原虫计数方法。血膜的制作（所需设备）血膜的制作（所需设备）v载玻片：新玻片新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片已用过的玻片浸泡于洗涤剂溶液中1-2天，或浸泡于煮沸的5%肥皂水中1-2小时，再放入新配置的洗涤剂溶液中1-2小时，逐个擦去血膜痕迹，清水漂洗干净，擦亮。v采血针：一次性v玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜v75%酒精棉球：采血前后消毒v记号笔：玻片上书写号码血膜的制作（取血时间）血膜的制作（取血时间）v

2、现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。v疟疟疾疾典典型型的的临临床床表表现现分分前前驱驱期期、发发冷冷（寒寒战战）期期、发发热热期期、出出汗汗期和间歇期五期。期和间歇期五期。F间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。F发发热热期期，外周血中以环环状状体体（小小滋滋养养体体）为为主主，也可见到裂裂殖殖体体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发发作作后后数数小小时时，间歇期外周血中以大大滋滋养养体体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发

3、作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体配子体出现较多。F恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，发发作作后后2 2小小时时左左右右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的7-10天。血膜的制作（取血操作）血膜的制作（取血操作）v在采集标本、制作血片前，首先要核对在采集标本、制作血片前，首先要核对患者的患者的姓名、年龄和住址姓名、年龄和住址。v取血部位和方法取血部位和方法F耳垂或无名指（婴幼儿耳垂或无名指（婴幼儿拇趾或足跟）拇趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇

4、指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅（12mm为宜）。然后用左手大拇指、食指和右手中指协同轻轻挤压出血滴。v用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜厚血膜。最好一张玻最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。片上同时制作厚、薄两种血膜。v涂制厚、薄血膜的位置涂制厚、薄血膜的位置 F作作为为标标本本的的血血片片每每张张玻玻片片涂涂厚厚、薄薄血血膜膜各各1 1个个。方方法法是是将将载载片片分分为为6 6等等分分，第第1 1、2 2格格备备贴贴标标签签及及编编号号用用；厚厚血血膜膜涂涂在在第第3 3格格中中

5、央央，薄薄血血膜膜涂涂在在第第4 4格格前前缘缘至第至第6 6格中部。格中部。F门门诊诊和和发发热热病病人人血血片片每每片片1 1人人，涂涂2 2个个厚厚血血膜膜1 1个个薄薄血膜，以防血膜脱落而影响检查。血膜，以防血膜脱落而影响检查。标本片标本片发热病人血片发热病人血片标签标签厚血膜的制作厚血膜的制作F取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，用推片的一角，从取血部位刮取约约45微升微升血量血量（相当于火柴头大小），），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径直径0.81cm大小圆形厚血膜大小圆形厚血膜。F位置，位于玻片位于玻片右右1/3处处（中央偏右或（

6、中央偏右或6等份中的与贴等份中的与贴标签的标签的1、2份相邻的第份相邻的第3份中部）。份中部）。外观，圆形厚薄圆形厚薄均匀，边缘整齐均匀，边缘整齐。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以1个油镜视野5-10个白细胞为宜。薄血膜的制作薄血膜的制作F用推片一端边缘的中点从取血部位刮取约刮取约11.5微升微升的血量的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，并形成并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽宽时时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。注意：注意：推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜

7、的厚薄。也可载玻片平置在桌面上操作。也可载玻片平置在桌面上操作。F位置，位于玻片左半部分或第位于玻片左半部分或第4格前缘到第格前缘到第6格中部格中部；外观，舌状厚薄均匀，无划痕舌状厚薄均匀，无划痕；应在玻片上形成平铺的红细胞，红细胞之间互相接触而不相互重叠。正确的推片姿势正确的推片姿势标准的疟疾厚薄血膜位置标准的疟疾厚薄血膜位置血膜的编号血膜的编号F血膜制成后，立即在玻片面上贴标签或写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。制作血膜注意事项制作血膜注意事项v清清洗洗玻玻片片，且且勿勿碰碰撞撞、磨磨损损 载玻片必须完全清

8、洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。v刚刚涂涂制制的的血血膜膜要要平平放放在在标标本本盒盒内内 厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。v血血膜膜应应自自然然干干燥燥 切忌在毒太阳下晒或火烤，加快其干燥可采用手背上或衣服摩擦、风吹，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏夏天天标标本本尽尽可可能能24-48h24-48h内内固固定定染染色色；冬冬天天也也不不能能超

9、超过过72h72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。染液的种类染液的种类v疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏瑞氏（Wright stainWright stain）和姬氏染液（）和姬氏染液（Giemsa stainGiemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂多色性染剂。v我们主要用姬氏染液姬氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大的门

10、诊实验室使用。染液的染色原理染液的染色原理v是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。F红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。F疟疟原原虫虫和和白白细细胞胞的的胞胞浆浆被被染染成成蓝蓝色色，红红细细胞胞、疟疟原虫和白细胞原虫和白细胞核核被染成被染成紫红色。紫红色。F红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、

11、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。v注意注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染染液的液的pHpH值值7.0-7.27.0-7.2较好。较好。v染液偏酸染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱染液偏碱时，红细胞和

12、嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。姬氏染液母液配置方法姬氏染液母液配置方法v材料：材料：1、姬氏粉、姬氏粉5克克 2、甘油、甘油250ml 3、甲醇、甲醇250mlv将姬氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶中，再次加甲醇洗后倒入瓶中，至洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，每天用力摇动5分钟，即成原液。配制1-2周后可以使用。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，能长期保存而不变质。F注意事项：注意事项：1.1.高纯度高纯度试剂。试剂。2.2.所所用

13、用器器皿皿绝绝对对无无水水（伊伊红红在在水水溶溶液液内内遇遇到到美美蓝蓝或或天天青青即即可可互相结合而产生沉淀，从而失去染色力）。互相结合而产生沉淀，从而失去染色力）。3.3.边边加加边边磨磨，充充分分研研磨磨；整整个个染染色色液液配配制制时时间间不不能能少少于于5 5个个小小时。时。姬氏染液的染色方法姬氏染液的染色方法v血片干燥后,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）,再用再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白清水对厚血膜溶脱血红蛋白(新制作的也可直接染色)，然后再进行染色。注意注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果。成批血片染色成批

14、血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%姬氏染液稀释液（3毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30-40min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。单张血片染色单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液2-32-3滴滴，加缓冲液缓冲液或蒸馏水或蒸馏水1ml1ml，混合均匀，染色15-2015-20分钟分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染（勿直接倾倒掉玻片上的染液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检液，防止渣滓附着在玻

15、片上冲不掉影响镜检）较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈疟原虫的胞质呈蓝色蓝色，核为紫红色核为紫红色，疟色素为棕褐色疟色素为棕褐色。快染快染 配制8-10%染液(每张血片约需染液2ml):量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加姬氏原液4-5滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10-15min，清水细缓冲洗，晾干镜检。慢染慢染 配制3%染液:在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水，再滴加姬氏原液2滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。姬氏染液浓度姬氏染液浓度门诊染色门诊染色血片制作染色评估考核标准血片制作染色评估考

16、核标准项目项目检查内容检查内容质量标准质量标准分值分值分分值值分分血片制作血片制作（80分）分）厚血膜（厚血膜（40分）分）血量（血量（10分）分）45l10略多或略少略多或略少7过多或过少过多或过少5位置（位置（10分）分）玻片右玻片右1/3 10稍偏右稍偏右7偏右过多偏右过多5直径（直径（10分）分）0.81.0cm100.70.8 或或1.01.2cm81.2cm5外观（外观（10分）分）圆形厚膜均匀，边缘整齐圆形厚膜均匀，边缘整齐10圆形稍不均不整齐圆形稍不均不整齐8厚薄不匀影响着色厚薄不匀影响着色5薄血膜（薄血膜（40分）分）血量（血量（10分）分）11.5l10略多或略少略多或略少

17、7过多或过少过多或过少5位置（位置（10分）分）长度（长度（10分分)外观（外观（10分分)玻片玻片1/21/3处处10稍偏右或偏左稍偏右或偏左7偏右或偏左过多偏右或偏左过多52.52.0cm10稍大或稍小稍大或稍小 8过多或过少过多或过少5舌状厚薄均匀舌状厚薄均匀10舌状稍不均舌状稍不均 8厚薄不匀呈波浪型厚薄不匀呈波浪型5血片染色质量（血片染色质量（10分）分）外观（外观（4分）分）蓝紫色蓝紫色4深蓝色深蓝色3深红色或灰白色深红色或灰白色2镜下（镜下（6分）分）白细胞、疟原虫胞浆蓝色，白细胞、疟原虫胞浆蓝色，核红色核红色6染色过深，原虫胞浆与核染色过深，原虫胞浆与核均呈深蓝色均呈深蓝色4染

18、色过浅，胞浆蓝色不易显染色过浅，胞浆蓝色不易显见，核淡红见，核淡红3血片清洁度（血片清洁度（10分）分）外观（外观（5分）分）光洁无油灰光洁无油灰5稍有油污稍有油污4油灰粘连油灰粘连2镜下（镜下（5分）分）无沉渣无沉渣5稍有沉渣稍有沉渣4沉渣多或有杂菌沉渣多或有杂菌3影响染色效果的因素影响染色效果的因素v血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等有关外，还受到以下因素的影响：（1 1）染剂、溶剂的质量染剂、溶剂的质量 染料、甲醇和甘油必须用分析纯，且在配制时所用的器具必须干净且无水份。（2 2）染液的新旧染液的新旧 染液存放时间越久，染色力越强。新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力

19、较弱且常呈现偏碱性。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密，以防吸潮而影响染液质量。（3 3）染液稀释后使用时间染液稀释后使用时间 必须现用现稀释染液，当时使用，一般在一般在0.5h内染色力最强内染色力最强。姬氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在甲醇中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。影响染色效果的因素影响染色效果的因素（4 4）染液的稀释浓度染液的稀释浓度 染液的浓度高，着色就快而深，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。（5 5）染色时间染色时间 染色时间应根据染液

20、的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。（6 6）染色用水染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择pH7.0-7.2缓冲液（缓冲液（NaNa2 2HPOHPO4 4,KH,KH2 2POPO4 4），也可以使用新鲜的蒸新鲜的蒸馏水馏水或过滤的冷开水过滤的冷开水。在现场无上述条件时也可用井水、河井水、河水、泉水或雨水水、泉水或雨水。（7 7）冲冲洗洗方方法法 应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒附着于血膜。血片染色注意事项血片染色注意事项 配置母液时过滤过滤可除去杂质颗粒

21、，有助于提高镜检质量。固定薄血膜时勿将勿将甲醇触碰甲醇触碰到到厚血膜。冲洗染液时，水流轻缓轻缓，勿冲走厚血膜。原虫密度计算原虫密度计算v估计疟原虫感染程度有三种方法：估计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法半定量计数法 检查厚血膜检查厚血膜白细胞原虫密度计数法检查厚血膜白细胞原虫密度计数法检查厚血膜红细胞感染率计算法检查薄血膜红细胞感染率计算法检查薄血膜v白细胞疟原虫密度计数法（白细胞疟原虫密度计数法（WHOWHO推荐推荐）用于疟疾研究用于疟疾研究用于临床诊断用于临床诊断用于抗疟后疟疾考核用于抗疟后疟疾考核v用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是

22、计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性只能定性，不宜作定量分不宜作定量分析析。v国内常用。此方法将密度分为6级：F全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字F全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”F平均每个视野15个虫，记录“”F平均每个视野610个虫，记录“+”F 平均每个视野11100个虫，记录“+”F 平均每个视野100个虫以上，记录“+”半定量计数法半定量计数法v在厚血膜，按要求选择视野，计数200个个白细胞，同时计数观察到的疟原虫数，如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。v白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数 计数的白细胞数 患者

23、每微升血的白细胞数=疟原虫数/l血。v如果不知患者的白细胞数，则每微升血以 8000个个白细胞计算(国际标准)，国内按6000个白细胞计算。白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫密度计数法白细胞疟原虫计数法举例白细胞疟原虫计数法举例v假设计数200 WBC的同时，计数了40个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：40（原虫数）（原虫数）200（白细胞数）（白细胞数）x 8000=1600/l血血从血膜的左上角开始，横向。计数从血膜的左上角开始，横向。计数1 1个视野后间个视野后间隔隔5 5个视野再计数。适用于疟原虫密度较高时。个视野

24、再计数。适用于疟原虫密度较高时。在在1 1个视野中，有时会重复计数。先把视野分成个视野中，有时会重复计数。先把视野分成4 4个象限，从右上象限起顺时针方向计数整个视野。个象限，从右上象限起顺时针方向计数整个视野。计数方法计数方法v薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。v镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫，不要笼统地记作混合感染。红细胞感染率计算法（薄血膜）红细胞感染率计算法（薄血膜）v疟原虫密度疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/微升血F红细胞原虫感染率（%）=疟原虫数 计数的红细胞数X 100%F涂制薄血膜的同时，计数每微升血液中红细胞数，也可按男性500万个/微升血、女性450万个/微升血计算。F疟原虫密度较高时，检查1000个红细胞即可，密度低时，可按公式N=45.5 X（IP）P计算需要检查的红细胞数。N为需要检查的红细胞数，P为1万个红细胞中的疟原虫数，I为血样单位（以1万个红细胞计算），45.5为常数。