食品有害微生物检测与控制 .ppt

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1、Zhejiang Pharmaceutical CollegeZhejiang Pharmaceutical College食品有害细菌检测与控制食品有害细菌检测与控制(8)施家威施家威反应抗原抗体Zhejiang Pharmaceutical CollegeCompany Logo1 1、什么是生理生化试验？、什么是生理生化试验？2 2、常见的生理生化试验出现的现象有哪些？常见的生理生化试验出现的现象有哪些？指通过利用生物化学的方法来测定微生物指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。类别、属种的试验

2、。Zhejiang Pharmaceutical College 1、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理2、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点3、影响抗原抗体反、影响抗原抗体反应的因素的因素4、免疫学、免疫学检测技技术的的类型型Ag(抗原):Antigen;Ab(抗体):AZhejiang Pharmaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理 抗原抗体反抗原抗体反应，指抗原与相，指抗原与相应抗体之抗体之间所所发生的生的特异性特异性结合合反反应。主要是指抗原和抗体在主要是指抗原和抗体在体外体外结合合所表所表现的反的反应。由于抗体主要存在于血清中，所以。由于抗

3、体主要存在于血清中，所以体外体外实验中的抗原抗体反中的抗原抗体反应曾称作曾称作血清学反血清学反应（serological reaction)。但是随着。但是随着免疫学的免疫学的发展，血清学的含展，血清学的含义已不能概括目已不能概括目前的研究内容，前的研究内容，现在多以抗原抗体反在多以抗原抗体反应代替代替血清学反血清学反应一一词。Zhejiang Pharmaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理静静电引力引力（electrostatic forces）范德范德华引力引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键:最具特异性

4、最具特异性（hydrogen bond）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大 1、抗原抗体结合力抗原抗体结合力（hydrophobic interactions）Zhejiang Pharmaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理1.1 静静电引力引力 抗原和抗体分子抗原和抗体分子带有相反有相反电荷的氨基和荷的氨基和羧基基基基团之之间相互的引力，称相互的引力，称为静静电引力，引力，又称又称库伦引力。引力。抗原抗体结合力抗原抗体结合力离子键强度的大小与两个相互作用基团间的距离的离子键强度的大小与两个相互作用基团间的距离的平方成反比。平方成反比。Zhejian

5、g Pharmaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理1.2范德范德华引力引力v概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的原子与原子、分子与分子由于分子极化作用而原子与原子、分子与分子由于分子极化作用而出现的引力。出现的引力。抗原抗体结合力抗原抗体结合力 作用大小取决作用大小取决于二者分子空间于二者分子空间构型的互补性构型的互补性 结合力的大小与两个结合力的大小与两个相互作用基团的极化程相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它度的乘积成正比、与它们之间距离的们之间距离的7 7次方成次方成反比。反比。Zhejiang Ph

6、armaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理1.3氢键结合力合力 供供氢体上的体上的氢原子与受原子与受氢体原子体原子间的引力。的引力。羧基、氨基和基、氨基和羟基是主要供基是主要供氢体，而体，而羧基氧、基氧、羧基碳和基碳和肽键氧等原子是主要受氧等原子是主要受氢体。体。抗原抗体结合力抗原抗体结合力 氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6 6次方成反比。次方成反比。最具特异性（必须供氢体和受氢体互补才能实现氢键的最具特异性（必须供氢体和受氢体互补才能实现氢键的结合）结合）Zhejiang Pharmaceutical Coll

7、ege一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理1.4 疏水作用力疏水作用力 两个疏水基两个疏水基团在水溶液中相互接触在水溶液中相互接触时，由于，由于对水分子排斥而水分子排斥而趋向聚集的力。向聚集的力。抗原抗体结合力抗原抗体结合力 结合力最强，约占结合力最强，约占总结合力的总结合力的5050。Zhejiang Pharmaceutical College一一、抗原抗体反、抗原抗体反应的原理的原理范德华力静电引力抗原疏水作用力排斥水抗体氢键结合力HH-+抗原抗体结合力抗原抗体结合力-+Zhejiang Pharmaceutical College一、抗原抗体反一、抗原抗体反应的原理的原理2.1亲

8、和力和力(affinity)抗体分子上一个抗原抗体分子上一个抗原结合点与合点与对应的抗原决定簇之的抗原决定簇之间相适相适应而存在着的引力，是抗原抗体而存在着的引力，是抗原抗体间固有的固有的结合力合力抗原抗体的亲和力和亲合力抗原抗体的亲和力和亲合力2、抗原抗体的、抗原抗体的亲和力和和力和亲合力合力Zhejiang Pharmaceutical CollegeCompany Logo12亲和常数（亲和常数（K K）：）：K K值越大值越大 抗体的亲和力越高抗体的亲和力越高 与抗原结合越牢固与抗原结合越牢固抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其Zhejiang

9、Pharmaceutical College一、抗原抗体反一、抗原抗体反应的原理的原理2.2亲合力合力(avidity)抗原抗体的亲和力和亲合力抗原抗体的亲和力和亲合力亲合力（亲合力（avidityavidity）：是指一个抗体分子与是指一个抗体分子与整个抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价整个抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关。另外也与亲和力强弱有关。直接相关。另外也与亲和力强弱有关。Zhejiang Pharmaceutical College一、抗原抗体反一、抗原抗体反应的原理的原理3、亲水胶体水胶体转化化为疏水胶体疏水胶体 抗体和大多数抗原同属蛋白抗体和大多数抗原同属蛋白质。

10、在通常的血清。在通常的血清学反学反应条件下均条件下均带有有负电荷，使极化的水分子在荷，使极化的水分子在其周其周围形成水化形成水化层，成，成为亲水胶体，因此蛋白水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出不会自行凝集出现沉淀。当沉淀。当Ag与与Ab结合后，表合后，表面面电荷减少，水化荷减少，水化层变薄；而且由于薄；而且由于Ag-Ab复合复合物形成后，与水接触的表面物形成后，与水接触的表面积减少，由减少，由亲水胶体水胶体转化化为疏水胶体。此疏水胶体。此时在在电解解质(如如NaCl)的作的作用下，使各疏水胶体之用下，使各疏水胶体之间进一步靠一步靠拢、沉淀，形、沉淀，形成可成可见的的Ag-Ab复合物。复合物。Zh

11、ejiang Pharmaceutical College一、抗原抗体反一、抗原抗体反应的原理的原理亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体可见反应可见反应抗原抗体复合物抗原抗体复合物 (疏水胶体疏水胶体)电解质电解质 抗原抗原(亲水胶体亲水胶体)抗体抗体(亲水胶体亲水胶体)+Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点特异性特异性 可逆性可逆性比例性比例性 阶段性阶段性Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点1、特异性、特异性特异性：特异性：抗原与抗体抗原与抗体结合

12、反应的专一性结合反应的专一性分子基础分子基础:抗原表位与抗抗原表位与抗体分子高变区之间空间体分子高变区之间空间构型的互补性构型的互补性抗原抗体反应特异性示意图抗原抗体反应特异性示意图 由于抗原抗体反应具有由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。应未知的抗体（或抗原）。Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点交叉反交叉反应（cross reactions）两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位

13、，可与彼此相应的发生反应构的抗原表位，可与彼此相应的发生反应特异性Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点2、可逆性、可逆性可逆性：可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性 影响因素影响因素:抗体对相应抗原的亲合力（亲合力越高，抗体对相应抗原的亲合力（亲合力越高，结合越牢固，越不易解离结合越牢固，越不易解离 ）环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响pHpH、离子强度、离子强度 Zhejiang Pharmaceut

14、ical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点3、比列性、比列性 Ag Ag与与AbAb的结合常需适当比例才出现可见反的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显；应，在最适比例时反应最明显；这种现象这种现象可以用可以用“格子学格子学说说”来解释：来解释：Ab(IgG)Ab(IgG)为二价，为二价，AgAg通常为多价，通常为多价，只有只有AgAg，AbAb结合结合形成大的复合物，形成大的复合物，肉眼才可见。肉眼才可见。Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点 只有当只有当AgAg与与AbAb比例适当

15、时，才能形成大比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现，此所谓带现象；而抑制反应现象的出现，此所谓带现象；前带现象：前带现象：AbAb过剩，过剩，AgAg过少；过少；稀释稀释AbAb，凝集反应常见；，凝集反应常见；后带现象：后带现象：AgAg过剩，过剩，AbAb过少；过少；稀释稀释AgAg、沉淀反应常见。、沉淀反应常见。比例性Zhejiang Pharmaceutical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点 比例性沉淀的抗体量抗原量抗原抗体反应与沉淀形成Zhejiang Pharmace

16、utical College二二、抗原抗体反、抗原抗体反应的特点的特点4、阶段性段性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象沉淀和细胞溶解等现象 Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素抗原、抗体反应物的自身因素抗原、抗体反应物的自身因素环境因素环境因素Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素1、反、反应物自

17、身因素物自身因素抗原抗原:理化性状、表位种类和数目理化性状、表位种类和数目抗体抗体:来源、特异性、亲和性、效价来源、特异性、亲和性、效价Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素1、反、反应物自身因素物自身因素1.11.1 抗原抗原 抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果可影响血清学反应结果 例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集；单价而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集；单价抗原与抗体

18、结合不出现可见反应；粗糙型细菌在抗原与抗体结合不出现可见反应；粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgGIgG类抗体结类抗体结合不出现直接凝集等。合不出现直接凝集等。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素反应物自身因素1.21.2 抗体抗体 抗体对反应的影响表现在以下三个方面抗体对反应的影响表现在以下三个方面:(1)(1)来源来源:来自不同动物的免疫血清，其反应性有来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等大多数动物的免疫血清具有较宽的等

19、价带价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（盐浓度（8.5%NaCl8.5%NaCl）溶液中沉淀现象明显。单克）溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗

20、原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素反应物自身因素(2)(2)特异性与亲和力特异性与亲和力 特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低；后期获得的抗血清一般亲和力较高，但亲和力低；后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。更为复杂。因此，用于检验的试剂必须尽量选用特异性高、因此，用于检验的试剂必须尽量选用特

21、异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。性。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素反应物自身因素（3 3）浓度）浓度:抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度抗体预滴定，找出最适反应浓度Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素2、环境因素境因

22、素2.12.1 电解质电解质 抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出现可见反应现可见反应;若无电解质存在，则不出现可见反应。若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以通常在血清学试验中，以0.85%NaCl0.85%NaCl溶液作为抗原溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中抗体的稀释液及反应液，其中Na+Na+和和Cl-Cl-可分别中和可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体

23、颗粒的电势下降，形成胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。可见的沉淀物或凝集物。电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。即盐析。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素2.2 2.2 酸碱度酸碱度 合适的合适的pHpH是抗原抗是抗原抗体反应的必要条件之一。体反应的必要条件之一。血清学试验一般以血清学试验一般以pH6-9pH6-9为

24、宜，超出此范围可影响为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。导致假阳性或假阴性结果。当当pHpH为为3 3左右时，接近细左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假非特异性酸凝集，造成假象。象。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素2.3 2.3 温度温度 抗原抗体反应一般在抗原抗体反应一般在15-4015-40范围内均可进行，范围内均可进行，最适温度为最适温度为3737。在此范围内温度越高，分子运动。在此范围内温度越高，分子运动速度加

25、快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，速度加快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，但亦容易引起复合物解离但亦容易引起复合物解离;温度越低，反应速度缓慢，温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在44时与红时与红细胞结合，细胞结合，2020以上反而解离。以上反而解离。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗

26、体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素2.4 2.4 作用时间作用时间抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。Zhejiang Pharmaceutical College三、影响抗原抗体反三、影响抗原抗体反应的因素的因素 此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。反应。电解质电解质:生理盐水或缓冲液生理盐水或缓冲液酸碱度酸碱度:pH6pH9温温 度度:1540，37最适最适Zhejiang Pharmaceutica

27、l College四四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型 反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断凝集反应凝集反应直接凝集试验直接凝集试验观察凝集现象观察凝集现象间接凝集试验间接凝集试验同上同上抗球蛋白试验抗球蛋白试验同上同上沉淀反应沉淀反应液相沉淀试验液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉观察扫描沉淀峰、沉淀弧淀弧补体参与补体参与的反应的反应补体溶血试验补体溶血试验观察测定溶血现象观察测定溶血现象补体结合试验补体结合试验同上同上Zhejiang Pharmaceutical College四四、抗体抗

28、原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型 反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断中和反应中和反应病毒中和试验病毒中和试验检测病毒感染性检测病毒感染性毒素中和试验毒素中和试验检测外毒素毒性检测外毒素毒性标记免疫反标记免疫反应应荧光免疫技术荧光免疫技术检测荧光现象检测荧光现象放射免疫技术放射免疫技术检测放射性强度检测放射性强度酶免疫技术酶免疫技术检测酶底物显色检测酶底物显色发光免疫技术发光免疫技术检测发光强度检测发光强度金免疫技术金免疫技术检测金颗粒沉淀检测金颗粒沉淀Zhejiang Pharmaceutical College四四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体

29、抗原（免疫学）检测技术的类型 1.1环状沉淀反应1、常见的免疫学检测技术n原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如果二者相应，则可在抗原、抗体两液接触界面形成白色的沉淀环。试验组阳性对照组 阴性对照组Zhejiang Pharmaceutical College四四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型 1.2双向琼脂扩散试验n 原理：原理：可溶性可溶性Ag与与Ab在含有电解质的半固体（在含有电解质的半固体（1%）琼脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度琼脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则扩散相遇时，如果二者相对应而且比

30、例适当，则可在相遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另可在相遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于组成它的外，沉淀带对于组成它的Ag、Ab具有特异地不具有特异地不可透过性，而对其它的可透过性，而对其它的Ag与与Ab是可透过的，所是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种以一条沉淀带仅代表一种AgAb系统的沉淀物。系统的沉淀物。Zhejiang Pharmaceutical College四四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型 Zhejiang Pharmaceutical College2 2、食源性微生物、食源性微生物检测中的中的应用用 酶联免疫吸附免疫吸

31、附测定定 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)是在是在酶联免疫技免疫技术的基的基础上上发展起来的免疫展起来的免疫测定技定技术。它的基本原理是将抗原或抗体吸附在固相它的基本原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，通体表面，通过加入加入酶标抗体或抗原，抗体或抗原，进行抗原行抗原抗体反抗体反应，形成，形成酶标免疫复合物，洗免疫复合物，洗涤后，后，游游离的离的酶标抗体或抗原被洗掉，再加入抗体或抗原被洗掉，再加入酶底物与免底物与免 疫复合物疫复合物结合合显色，色，进而而进行定性或定量行定性或定量测定定四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测

32、技术的类型2.1 2.1 酶联免疫吸附免疫吸附测定技定技术Zhejiang Pharmaceutical College 阪崎阪崎肠杆菌杆菌(ES)是一种是一种对新生儿和免疫力新生儿和免疫力低下人群的高危致病微生物，周低下人群的高危致病微生物，周鹤峰等通峰等通过制制备 ES 高特异性高特异性单克隆抗体克隆抗体对其其进行特异性行特异性间接接 ELISA 检测，大幅降低，大幅降低检测成本，具有灵敏度成本，具有灵敏度高、高、稳定性定性强、特异性、特异性强、便捷等特点，、便捷等特点，为食品食品中中 ES 的快速的快速检测奠定了研究基奠定了研究基础四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学

33、）检测技术的类型周鹤峰,邵敏,李长福,葛正龙.检测阪崎肠杆菌间接ELISA方法的建立J.中国乳品工业,2013,41(01):51-Zhejiang Pharmaceutical College 四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型2.12.1免疫免疫层析技析技术免疫层析技术IC(immunochromatography)始于M.Beggs 等设计的人绒毛促性腺激素免疫胶体金层析系统Zhejiang Pharmaceutical College2.2.1 2.2.1 荧光微球免疫光微球免疫层析技析技术 荧光微球免疫光微球免疫层析技析技术的原理是利用的原理是利

34、用荧光光微球表面修微球表面修饰的的羧基可共价基可共价结合抗体合抗体发出的出的荧光光信号信号强而而稳定的特点定的特点发展起来的新型展起来的新型检测技技术，具有易于定量具有易于定量检测的特点的特点四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College 解泉源等通解泉源等通过以下方法制以下方法制备大大肠杆菌杆菌O157 H7荧光光微球免疫微球免疫层析析试纸条条进行食源性微行食源性微 生物生物检测 先将先将荧光微球光微球羧基化，用基化，用 EDC 介介导共价共价 偶偶联鼠源抗大鼠源抗大肠杆菌杆菌 O157 H7 单克隆抗体

35、，将克隆抗体，将喷 涂在硝酸涂在硝酸纤维素膜上的素膜上的兔多抗和兔多抗和驴抗鼠抗体分抗鼠抗体分别 作作为检测线(T 线)和和质控控线(C 线)，进而确定免疫而确定免疫 层析反析反应动态平衡平衡时间，再利，再利用双抗体用双抗体夹心心显色，色，测定吸光度，定吸光度，进而达到定量而达到定量检测的的目的目的 应用用荧光光 微球免疫微球免疫层析技析技术制制备的的试纸条能同条能同时检测 4 株目株目 标菌与菌与 34 株不同种株不同种类的食源性微生物，的食源性微生物，目目标菌菌仅与与 金黄色葡萄球菌有微弱交叉反金黄色葡萄球菌有微弱交叉反应，特异性，特异性较好，并好，并 且具有操作且具有操作简便、速度快的特

36、点便、速度快的特点四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型解泉源,赖卫华,刘春梅,等.大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制J.食品科学,2013,34(16):353-Zhejiang Pharmaceutical College2.2.22.2.2胶体金免疫胶体金免疫层析技析技术 免疫胶体金技免疫胶体金技术 GICA(immune colloidal gold technique)是以胶体金作是以胶体金作为示踪示踪标记物物应用于免疫反用于免疫反应的新型免疫的新型免疫标记技技术，可用于，可用于检测食品中常食品中常见的致病菌的致病菌(大大肠杆菌、杆菌

37、、金黄色葡萄球菌、沙金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、霍乱弧氏菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等菌等)。四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College 王玉金等通王玉金等通过 3 步建立大步建立大肠杆菌杆菌 O157 H7的胶体金免疫的胶体金免疫层析快速析快速筛查方法。目方法。目标菌与菌与 9 种常种常见食源性微生物食源性微生物(非非 O157 H7 大大肠杆菌、杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、霍形杆菌、霍乱杆菌、副溶血性弧菌、乱杆菌、副溶血性弧菌、肠球菌、黏球菌、黏质沙雷氏菌沙雷氏菌、肺炎克

38、雷伯杆菌、肺炎克雷伯杆菌)同同时检测无交叉反无交叉反应，特异，特异性性强四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型王玉金,杨书豪,刘丽,等.大肠杆菌O157H7胶体金免疫层析快速检测法的建立J.河南科学,2012,30(07):874-Zhejiang Pharmaceutical College2.2.3 2.2.3 纳米金技米金技术 自从自从 16 世世纪欧洲欧洲现代化学的奠基人、杰出代化学的奠基人、杰出的医的医师化学家化学家 Paracelsus 制制备出出“饮用金用金”用用来治来治疗精神精神类疾病以来，疾病以来，纳米金米金(nanogold)就开始受到重就

39、开始受到重视 纳米金指金的微小米金指金的微小颗粒，直粒，直径径 1 100 nm，具有高，具有高电子密度、介子密度、介电特性特性和催化作用，能与多种生物大分子和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影合，且不影响其生物活性响其生物活性 由于易于制由于易于制备和修和修饰，因此被，因此被广泛使用广泛使用四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠毒素毒素 B(SEB)是一种常是一种常见的影响食品特的影响食品特别是乳品是乳品质量安全的高量安全的高风险食源食源性微生物毒素，性微生物

40、毒素，孙秀秀兰等采用离子液体保等采用离子液体保护的聚的聚苯胺苯胺纳米金复合膜米金复合膜传感器感器对其其进行行检测。离子液。离子液体保体保护的聚苯胺的聚苯胺纳米金复合膜比米金复合膜比传统纳米金离子米金离子能更有效地阻止金的聚合，且具有更高的分散性能更有效地阻止金的聚合，且具有更高的分散性，聚苯胺，聚苯胺导电膜可提高材料膜可提高材料传导性以降低性以降低检出限出限，复合膜保，复合膜保护剂进一步一步稳定抗体，定抗体，进而提高而提高检测结果的果的稳定性定性 修修饰的复合膜的复合膜传感器克服了感器克服了 ELISA 易出易出现假阳性的缺陷，乳品假阳性的缺陷，乳品检测回收率回收率在在 88%119%之之间。

41、四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型朱珠,王永,兰青阔,等.应用焦磷酸测序技术快速检测食品中沙门氏菌J.食品科学,2013,34(02):182-Zhejiang Pharmaceutical College2.32.3免疫磁珠分离技免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离法是将磁性微球与免疫化学技免疫磁珠分离法是将磁性微球与免疫化学技术结合起来的一种方法合起来的一种方法 该方法先用抗体包被方法先用抗体包被的磁珠与的磁珠与样品混合，再用一个磁品混合，再用一个磁场装置收集磁珠装置收集磁珠 免疫磁珠分离法能快速地从食品成分中分离免疫磁珠分离法能快速地从食品成分中分离出靶出

42、靶细菌，克服菌，克服选择性培养基的抑制作用性培养基的抑制作用四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College2.42.4酶联荧光免疫分析技光免疫分析技术 ELFIA(enzyme-linked fluorescent immunoassay)是在是在酶联免免疫吸附技疫吸附技术基基础上上发展起来的将展起来的将酶系系统与与荧光免光免疫分析疫分析结合的微生物快速合的微生物快速检测技技术。它是利用理。它是利用理想的想的荧光底物代替生色底物，光底物代替生色底物，实现提高分析灵敏提高分析灵敏度，度，扩大大测量范量范围以及

43、减少以及减少试剂用量的目的用量的目的四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College2.42.4化学化学发光免疫分析技光免疫分析技术化学化学发光免疫分析光免疫分析 CLIA(chemiluminescence immunoassay technique)是将具有高灵敏度的化学是将具有高灵敏度的化学发光光测定技定技术与高特异性的免疫反与高特异性的免疫反应结合的新型免疫合的新型免疫测定技定技术四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical C

44、ollege小结小结 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。生的特异性结合反应。抗原抗体之间的结合力涉及静电引力、范德抗原抗体之间的结合力涉及静电引力、范德华引力、氢键和疏水作用力。华引力、氢键和疏水作用力。抗原抗体反应的特点是特异性、可逆性、比抗原抗体反应的特点是特异性、可逆性、比例性和阶段性。例性和阶段性。影响抗原抗体反应的因素包括反应物的自身影响抗原抗体反应的因素包括反应物的自身因素和环境因素。因素和环境因素。免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应四、四、抗体抗原（免疫学）检测技术的类型抗体抗原（免疫学）检测技术的类型Zhejiang Pharmaceutical College作作业v介介绍基于以下任一一种技基于以下任一一种技术的的视频有害微有害微生物生物检测方法，并方法，并进行介行介绍。v免疫磁珠分离技免疫磁珠分离技术v酶联荧光免疫分析技光免疫分析技术v化学化学发光免疫分析技光免疫分析技术v要求：要求：书面介面介绍不少于不少于500500字；字；v PPT PPT介介绍不少于不少于5min;5min;v 下下节课随机上台介随机上台介绍。Company LogoZhejiang Pharmaceutical CollegeZhejiang Pharmaceutical College