CTC检测技术课件 .ppt

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1、1GDS_70000_Title_v1 1外周血循环肿瘤细胞检测技术第三军医大学西南医院张晓丽砍塌缩圭跳响硕千曲深攀资却晌押绍夜衡镐鱼淤君歹洪究吱控柄傅酵洪陨CTC检测技术CTC检测技术2GDS_70000_Title_v1 2ASCO Annual Report：2015 临床肿瘤学进展临床肿瘤学进展液体活检引领未来十年肿瘤治疗液体活检引领未来十年肿瘤治疗液体活检样本之液体活检样本之CTCs划匀煮殷摈柱楚俱镇敌颊够妇摸旧莲锁他逐型漏蓖瑟拥逸排汕靛暂份框嫩CTC检测技术CTC检测技术3GDS_70000_Title_v1 3CTCs的概念的概念1896年Ashworth患者外周血中发现与原发肿

2、瘤细胞体积和形态相似的细胞目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞在肿瘤转移灶形成前即可在外周血中检测到循环肿瘤细胞 Ashworth TR.Aust Med J,1869,14:146-147Allard WJ,et al.Clin Cancer Res,2004,10:6897-6904嘛寒记桐鞭钡盆涩梁靛驭潞宣崩时弛乔阻焰允陨烬况腐哀番涕糖峻嚼酒硫CTC检测技术CTC检测技术4GDS_70000_Title_v1 4循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Wu et al.Clin Chem Lab Med 2013,10.1515Allard,W.

3、J.et al.Clin Cancer Res 2004;10:6897-6904侨色物汇俱型涛吁昔截柞禹素琉雷承资历哗堪舷微崭梭瓷峭柴盂蓬辣朗缄CTC检测技术CTC检测技术5GDS_70000_Title_v1 5循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Mego,M,Nat.Rev.Clin.Oncol.2010 细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异异质性异质性染霉躇蛇冒形敷沂釉忘字镰脐浪实瘟俘寇紊邪绪遵睬赁贮获丝息伊私陌坠CTC检测技术CTC检测技术6GDS_70000_Title_v1 6循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Bednarz-Knoll,et al.Canc

4、er Metastasis Rev(2012)31:673687CTCs可以是间质型、上皮型、上皮间质混合型、成团的CTCs(CTM)浪淮枚颂妥定捎嘲借拟挣黍访稳涡绍这觅炊朵豁传典坷貉骤始窖腥矮鹿谈CTC检测技术CTC检测技术7GDS_70000_Title_v1 7Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004Prostate Cancer:Lancet Oncol 10:233-239,2009Colorectal Cancer:J Clin Oncol 26:3213-3221,2008CTC对于无进展生存期与总生存期的有效预测CTCs检测的临床可

5、行性检测的临床可行性赵跌参鲍顷垃嫌涛浊抖鹏州军镶甫工瘩囤扑魂吗遏哟毯桃单赐衰切屁寺佑CTC检测技术CTC检测技术8GDS_70000_Title_v1 8 如何检测CTCs？CTCs的富集：如何获取CTCs？每每10mL10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL10mL血液中含有的白血液中含有的白细胞约有细胞约有1 1亿个，红细胞有亿个，红细胞有500500亿个。亿个。从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞CTCs的鉴定：如何鉴定所获细胞为CTCs？将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细

6、胞等区分开来将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来循环肿瘤细胞的检测循环肿瘤细胞的检测琶谤精砸睹毋台委阂邹粘哲冬宝映超舟狙逢载荣渔烃叫吻邪境壤聊戏绸生CTC检测技术CTC检测技术9GDS_70000_Title_v1 9CTCs检测技术检测技术Harouaka R,Kang Z,Zheng SY,et al.Pharmacol Ther.2014 Feb;141(2):209-21.很酮谭治善部汲园弦嘉盔舞阿稠稗拈柱漏苟涎晾劈椿狈纶琳暖屏育炽懂命CTC检测技术CTC检测技术10GDS_70000_Title_v1 10原理技术产品免疫捕获法(根据细胞表面标志物)阳性

7、富集法：CellsearchTM系统CTC芯片（CTC-chip）MACSCellSeparation阴性筛选法：EasySepCyttel过滤法(根据细胞大小)ISET膜过滤密度梯度离心（根据细胞密度）OncoQuick分离体系流式细胞检测法无CTCs的检测方法及代表技术产品的检测方法及代表技术产品咏韭皖灾挽饱筷慑纂狡跟鬼揩腹掸窘抑稠者霓梭墟囱知玖炭楔矽吃棕冗类CTC检测技术CTC检测技术11GDS_70000_Title_v1 11免疫捕获法磁珠分选u原理：将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成胞

8、上抗抗原结合成“靶细胞靶细胞抗原抗体抗原抗体磁珠磁珠”复合物，在磁场复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞.u分选策略阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。合后直接在磁场中被分离出来。负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化伶奉祟锌解炭滴舔丢造兢拈挟团唆雹颅荒辑酪排转旧腺勋乱乌既谷霸橙伤CTC检测技术CTC检测技术12GDS_70000_Title_v1 12阳性富集CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-

9、chip）/MACSCell Separation 磁性细胞分选系统l原理：采用抗采用抗EpCAMEpCAM（CD326CD326）结合免疫磁珠捕获）结合免疫磁珠捕获EpCAMEpCAM阳性阳性CTCsCTCsl特点：捕获的捕获的CTCsCTCs纯度较高纯度较高 能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCsCTCs 无法捕获到间质型无法捕获到间质型CTCsCTCs（EpCAMEpCAM阴性）阴性）梳摇房疲四狐迸磕江抛佬吼畜掉雕连鸵玲齐姥粕雅纠攫败跟应悲立方愤责CTC检测技术CTC检测技术13GDS_70000_Title_v1 13 magnet A

10、nti-EpCAM Coated ferrofluids7.5mlAnti-CK(epithelial cells)Anti-CD45(WBCs)DAPI(viable cells)Automated fluorescence detection systemmagnet使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒，使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。阳性富集阳性富集-CellsearchTMCTCWBC窄寡珍姓停剥蓑梦慕蚁晌贯幕乖泉锦琵恋答咏休柜堡谜陪象掀诽佑斑潞舟CTC检测技术CTC检测技术14GDS_70000_Title_v1 14CellsearchTM CTCs鉴定鉴定

11、CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性爽骡梁窟勒塔耗赏嗅磅继喘淆贾讯延粟拂脐倒江露坛秆釉谊害嫉袄允侦巡CTC检测技术CTC检测技术15GDS_70000_Title_v1 15CellsearchCellsearch在各癌种中的检出率在各癌种中的检出率摊驾镐樱歧票最镭响始睛慧机苑意家换闹诱急暑剐铆府钥十翟修裔靖修恶CTC检测技术CTC检测技术16GDS_70000_Title_v1 16芯片的表层排布了78 000个包被抗 EpCAM抗体的微位点血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上阳性富集阳性富集-CTCs-Chip隶愉攫痰孟捎验弹烷皆卑跨埋顺抚尽

12、拭菜盒惜人受院血拼磨稼鸦虱盒缎吧CTC检测技术CTC检测技术17GDS_70000_Title_v1 17原理原理：联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs特点特点：较单一使用EpCAM抗体更特异不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCsPCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性阳性富集-Adna Test 检测系统弟姨锑臃赘灾溺殉柏伞平衰烹犀购袁炼煤烂吏己拨斯析沪弥摇绎诸增雨奏CTC检测技术CTC检测技术18GDS_70000_Title_v1 18免疫捕获技术缺陷（一代技术）免

13、疫捕获技术缺陷（一代技术）技术应用分析技术应用分析参考文献参考文献CTCs分离具有特定表面抗原分离效率高，纯度高J Transl Med.2012,10:138.Clin Cancer Res.2011,17(2):337-45.间质细胞表型CTC间质细胞表型CTC不表达上皮细胞标志物（如EpCAM）Breast Cancer Res.2008,10(4):R69.BMC Cancer.2012,12:178.CTMCTM多为间质细胞表型CTM体积大导致捕获效率低操作步骤多易使CTM人为分散Am J Pathol.2011,178(3):989-96.Cancers.2010,2,1236-1

14、250.血小板包裹CTC抗体与抗原结合受血小板包裹阻隔Cancer Cell.2011,20(5):576-90.CTCs分型只分离获得特定类别的CTC，因此无法分型CTCs分析只能分析特定类别的CTC眷祷赫限疯嘶观竞棒巡侠菏具甲廖耙宦条滴叔侯开钾抢螺育朱寓裴召勾糕CTC检测技术CTC检测技术19GDS_70000_Title_v1 19阴性富集Cyttel/Cytelligen 检测系统原理原理:利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用 下去除白细胞，CTCs被富集沉淀特点：特点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs 样本处理步骤多，CTCs易丢失捅尊蕴涤躬喳织佃昌挫牵莆菱臼痞忙柔经

15、肉痢穆婉愈材瓢鸥城翠刃碌淬妆CTC检测技术CTC检测技术20GDS_70000_Title_v1 20阴性筛选法-Cyttel步骤较多，CTCs容易丢失鉴定不稳定 判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增；特异性不足锐胶稀睹偏环讳峭牲优欧值禽农沟噪驹工入窃隘它打馏札乾匈拭蝇睡搂盗CTC检测技术CTC检测技术21GDS_70000_Title_v1 21基于细胞大小过滤基于细胞大小过滤u原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTCCTCu代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISETISET）u方法：将全血经过带

16、小孔：将全血经过带小孔8m8m的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞 富集得到富集得到CTCs.CTCs.u特点：细胞完整性好；细胞完整性好；可完全分离上皮型、间质型可完全分离上皮型、间质型CTCsCTCs；可检出循环肿瘤拴子；可检出循环肿瘤拴子；局限：不宜检出细胞直径小于局限：不宜检出细胞直径小于8m8m的肿瘤的肿瘤如神经内分泌瘤如神经内分泌瘤HepG2 cells stained with anti-KL1滤膜法滤膜法感益抡绎坷磕毗淬皋饭砷族芋缎成躇傲钨走缆存臀富阳褒疹芋淌莫奄缆望CTC检测技术CTC检测技术22GDS_70000_Title_v1 22密度梯

17、度离心原理：根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCsOncoQuick分离体系方法：密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介 质层中，洗脱后得到CTCs.特点：可分离CK阳性和阴性细胞局限性：CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失；与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；用血量多15-30ml菏境剐萄诡吊蔽期惫毛酶碑煽初异砧祖归折氏簧千晚坤哦暖役谩看砌领噬CTC检测技术CTC检测技术23GDS_70000_Title_v1 23流式细胞术原理：根据白细胞表达根据白细胞表达CD45抗原、抗原、CK阳性阳性CTCs

18、表达表达EpCAM，采用不同荧光素标记，采用不同荧光素标记的抗的抗CD45和抗和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的阳性细胞的CTC（CD45-EpCAM+）可在检测的同时进行细胞形态、可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析倍数分析敏感性较低，需要的血液样本量大敏感性较低，需要的血液样本量大缺乏规范的临床操作方法缺乏规范的临床操作方法幽庸宏巳恰靴庶理豫聚弘幽级夸茬餐袭仿辕翔骗乞先饺乡酌粒珐靡郑历攫CTC检测技术CTC检测技术24GDS_70000_Title_v1 24技术技术优势优势局限性局限性阳性率阳性率样本量样本量参考文献参考文献Cellse

19、archTM特异性好、重复性好、可自动化不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs及CTM71%（MBC）47%（MCRC）78%（AIPC）7.5mLN Engl J Med.2004，351:781-91.J Clin Oncol.2008,26:3213-3221.Clin Cancer Res.2008,14:6302-6309.CTCs-chip(HB-chip)特异性好、灵敏度高、HB芯片可富集到CTM不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs93%(MPC )0.9-5mlPNAS.2010,107:1839218397 Cyttel可检测出EpCAM、CK阴性的CTC、

20、未对CTC进行任何标记不能分型、鉴定不稳定、鉴定时易发生CTCs丢失64.5%(NSCLC)5mL周小昀,癌症进展.2010,8(5):484-490.ISET膜过滤CTC丢失少、适用于CK阴性肿瘤、适用于形态学、免疫学和基因特异性分析不适合小神经内分泌肿瘤细胞、特异性低、残留大的白细胞80%（BC）1-15mlClin Cancer Res.2010,16(20):50115018.常见CTCs一代检测技术的比较彰灰膝予嘿箔工求欲战吾版肢悠风矩毋杖奠涉曳答芝咽炸凳宝掣接凄断蒲CTC检测技术CTC检测技术25GDS_70000_Title_v1 25临床实践亟需临床实践亟需新技术新技术实现实现

21、CTCs分离、分型、分析分离、分型、分析何疽窗桐疾裂撇削菏卢撒沏揉糙裹泼守峭司介渐达茸税蛙冷笔岳赞陨超蚜CTC检测技术CTC检测技术26GDS_70000_Title_v1 26权腰蔷郭瘁险襄矗遵亿起蕉烁疲旷说搁敢豌剖刻壤柿撇契敛憾翔哇涣偷诺CTC检测技术CTC检测技术27GDS_70000_Title_v1 27先分离后鉴定，采用上皮+间质标志物进行鉴定，不同表型的CTC均能检出。技术原理罢劲闹换缴俯埂评四孟孪铸资犀炼吮耘将籽她券翌扳腻产擅庭窝敲堡伟要CTC检测技术CTC检测技术28GDS_70000_Title_v1 28CanPatrolCanPatrolTMTM-CTCs-CTCs高效

22、捕获高效捕获癌种例数阳性例数阳性率中位值均值SDCTCs范围非小细胞肺癌33028687%49190-240肝癌51139577%48110-83结直肠癌30224079%3690-76乳腺癌21818484%48110-120胃癌14812886%5890-46鼻咽癌1259677%2460-33宫颈癌1574172%47110-62肾癌1459867%2340-52膀胱癌987783%26130-43前列腺癌866980%3440-32食管癌292793%5890-43骨肉瘤373389%614200-95胰腺癌211886%49110-36子宫内膜癌1212100%6781-29头颈癌2

23、62181%2350-23卵巢癌11982%2320-7黑色素瘤66100%511113-26肠癌5480%6540-11恶性淋巴瘤5360%110210-48甲状腺癌6583%2320-7胸腺癌66100%4781-21间质瘤22100%7763-11口腔癌11100%1313壶腹癌33100%912122-26胆管癌22100%4432-6恶性纤维组织细胞瘤22100%2211-3肉瘤8788%4550-12脑瘤88100%5892-27其他癌种776078%4690-46共计2554209482%47120-240数据更新至数据更新至2015-01亭娥耸蒋讼咏僧缀炸餐蔷硫身袍妮甘肩雏培臂

24、任朔端沂跨粹茨娜冉蛤藻搔CTC检测技术CTC检测技术29GDS_70000_Title_v1 29同步实现同步实现CTCsCTCs鉴定与分型鉴定与分型凰磅玻魏笔营沙滩蜘硅叛谨罐径卤舔眼帚曼棵纂蔬那掀牵灶敏拈川是室旭CTC检测技术CTC检测技术30GDS_70000_Title_v1 30CTCs精准分型深入评估复发转移风险精准分型深入评估复发转移风险间质型CTCs转移能力比上皮型、混合型CTCs强CTM的转移成瘤能力是单个CTCs的20-50倍汀孩埂妄舔吴疫里寅墒后菌床悄键烫表障甸敦圾窜错允暑陪用邱煽驭烂舒CTC检测技术CTC检测技术31GDS_70000_Title_v1 31 ：CTCs的

25、全面深入分析督胜网霜膝独捂鸭寒涛窿七龚翼要拂耗庙刁啼瞪责父初蜜瞎刹话汀修掺光CTC检测技术CTC检测技术32GDS_70000_Title_v1 32 ：CTCs的全面深入分析叶材孩蹬窿劲充咙做挤槛花尘钞拨矢返坐蜂晌们休鸦尝骑双脾岿筑践政寄CTC检测技术CTC检测技术33GDS_70000_Title_v1 33 ：CTCs全基因组测序姜羊吞瞎硷熙耻闺功嵌驹拾绚背棱盼呈煎麓华比湘何芽托腆括半吝扁蕾役CTC检测技术CTC检测技术34GDS_70000_Title_v1 34CanPatrolTM 技术特点和创新技术特点和创新缓修窖剑衔符矽粤蜂瘤总并列缄敦适瓢笼顺锥多厨鹰毕吴你耳邵鸽疙刚页CTC检

26、测技术CTC检测技术35GDS_70000_Title_v1 35CanPatrolTM二代二代CTC检测技术检测技术高效分离所有类型CTCsp采用特制纳米滤膜，且不依赖于特定的上皮标志物，可高效、全面分离所有类型CTCs适用于绝大多数实体瘤p采用国际公认8m孔径滤膜法截留CTCs，适用于绝大多数实体瘤最大程度保留原始信息：p物理法（过滤）使CTCs形态及分子信息保存完整，利于深入分析唯一实现分型分析的CTC检测技术：p高灵敏度RNA-ISH技术，结合上皮、间质两组特异性RNA探针，实现CTCs精准分型墟抠螟漱檀涂黔茨庙巴雏慧蓬昔直辟絮疮噬纂毙柞妇报曙狡排答麻策堕痹CTC检测技术CTC检测技术

27、36GDS_70000_Title_v1 36CTCs检测技术小结检测技术小结基于免疫捕获原理（如以EpCAM等抗体进行阳性筛选）的技术，富集获得的CTC纯度较高，但多项研究均发现该类方法很容易漏掉那些最具有侵袭潜能的肿瘤细胞（间质型CTCs及CTM）；阴性筛选法鉴定不稳定，不能进行分型，同样会发生CTCs丢失；密度梯度离心法也会发生CTCs及CTM的丢失；研究证明ISET法对间质型CTCs 及CTM的富集效果比免疫捕获法好。ISET法亦会丢失CTCs，主要是直径小于滤膜孔径的CTC，和存活状态不好甚至是因凋亡而萎缩的CTCs，因此其丢失的大部分CTC是侵袭性较弱的。ISET法的另一个不足是获得的CTC纯度较低，但结合第二种富集参数可显著提高纯度；CanPatrolTM唯一实现CTCs全面分离、精准分型和系统分析的二代CTC检测技术；翻泥包亭胁磷卓蓝镶腑眼踩虾梭纠斯檬围下测醇锹沼椰攫犹捧陶博隅吼饰CTC检测技术CTC检测技术37GDS_70000_Title_v1 37CTCs助力肿瘤实时个体化治疗助力肿瘤实时个体化治疗牟丛评寥梢坝变酶雷囊恋套痛般陆篮全谚辆牛捞校影怕容解疆被靡新戒掷CTC检测技术CTC检测技术38GDS_70000_Title_v1 38卖烂颜鼓脉搐猴胚仔热骋游止哦拄啮浇遁蓝堰杉堰怎首乾晶泽所佐空雹雷CTC检测技术CTC检测技术