药物预防治疗对变应性鼻炎患者发病的影响 .ppt

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1、小鼠小鼠IL-4RIL-4R基因基因shRNAshRNA有效靶点的筛选有效靶点的筛选王 旻北京大学人民医院 耳鼻喉科变应性鼻炎的治疗策略变应性鼻炎的治疗策略避开致敏原几乎不可能药物治疗部分患者疗效不肯定 副作用免疫治疗适应症窄 寻求一种有效的治疗方法可不容缓治疗进展转录后的抑制是变应性疾病的治疗热点。反义RNA 和小干扰RNAs(siRNAs)是最为常用的方法.Andrew FireCraig MelloNature 1998;391(6669):806-112006年诺贝尔医学奖获得者小干扰RNAs的原理RNA干扰是存在于真核细胞内的一种自我保护现象，既能对抗降解如病毒、自身异常基因产生的m

2、RNA。主要发生在基因转录后，即mRNA的修饰或翻译水平上，具有特异、高效和持久的特点。小干扰RNAs的优势siRNA 是双链结构,更稳定;siRNA 不需要化学修饰;RNAi 技术不存RNase H 酶或立体结构抑制作用;RNAi 技术具有效应放大作用,IL-4R变应性疾病的重要作用IL-4和IL-13酪氨酸激酶偶联受体信号通路（Jak-Stat途径）在IgE依赖的变应性反应中起着关键作用 IL-4R 是该通路的核心分子目的n本研究探讨设计IL-4R的短发夹RNA（shRNA）序列，并合成IL-4R的RNA干扰载体，筛选有效shRNA干扰靶点。实验步骤1目的基因目的基因RNA干扰载体制备干扰

3、载体制备2融合蛋白表达载体构建融合蛋白表达载体构建3RNA干扰有效靶点筛选干扰有效靶点筛选1目的基因目的基因RNA干扰载体制备干扰载体制备MarkerTargetSequenceSD-1GCCAGGAGTCAACCAAGTASD-2AGGAGTTTGTGCAGGCAGTSD-3AGAAGATGAGATAGTCAAASD-NCTTCTCCGAACGTGTCACGTshRNA载体的构建 酶切酶切pGCsi载体以使其线性化载体以使其线性化双链双链DNA oligo制备制备克隆连接克隆连接转化转化鉴定鉴定PCR鉴定鉴定:挑选阳性克隆菌液送测序2融合蛋白表达载体构建（构建融合表达载融合蛋白表达载体构建（

4、构建融合表达载体体pEGFP-N1-Il4ra）通过外源性靶点的筛选，所以首先要构建融合蛋白，即包含有绿色荧光蛋白的载体同IL-4R的序列融合在一起PCR阳性克隆鉴定图片 正确克隆于表达载体的目的基因片段能正确克隆于表达载体的目的基因片段能够与够与EGFP融合表达融合表达荧光镜检图片：荧光镜检图片：3RNA干扰有效靶点筛选采用荧光镜检检测目的基因不同的RNAi靶点干扰情况下的敲减效率PCl组为单转染过表达融合蛋白质粒的细胞组；NC为共转染阴性shRNA对照组；1#-3#为共转染不同靶点shRNA组；PC NC 1#2#3#采用WesternBlot检测目的基因不同的RNA靶点干扰情况下的敲减效率 3#靶点对外源表达的目的基因，对蛋白水平有最明显的knockdown作用，灰度分析显示，3#靶点对Il4ra的knockdown效率大于90%，该靶点可以进入慢病毒的构建包装，用以完成后期的整体实验。低浓度组 高浓度组