实验一微生物培养基的配制和灭菌 .ppt

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1、微生物学实验进入微生物实验室的注意事项进入微生物实验室的注意事项n1.1.进入实验室必须穿白大褂进入实验室必须穿白大褂n2.2.实验室内不准吃东西实验室内不准吃东西n3.3.在实验室内不要趴在桌子上在实验室内不要趴在桌子上n4.4.实验完成后值日生留下做好清洁工作实验完成后值日生留下做好清洁工作（值日工作班委负值日工作班委负责制，纳入实验成绩）责制，纳入实验成绩）n5.5.离开实验室前洗手离开实验室前洗手n6.6.实验现象要隔天观察的实验，必须要按时到实验室记录实验现象要隔天观察的实验，必须要按时到实验室记录实验现象实验现象前三次实验安排n实验一 培养基的制备和高压蒸汽灭菌（4学时）n实验二

2、微生物的纯培养技术（4学时）n实验三 微生物形态的观察及革兰氏染色（4学时）实验报告要求实验报告要求n一个实验，一份实验报告，有连续性的实验等到做一个实验，一份实验报告，有连续性的实验等到做完后再写实验报告。完后再写实验报告。n实验报告内容：实验报告内容：1.1.实验项目名称实验项目名称 2.2.实验目的实验目的3.3.实验原理实验原理 4.4.实验材料与器材实验材料与器材5.5.实验步骤实验步骤6.6.实验结果与分析（即使实验失败也要写好分析）实验结果与分析（即使实验失败也要写好分析）7.7.思考题思考题实实 验验 一一培养基的制备和培养基的制备和高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌一、实一、实 验验

3、目目 的的n了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。程。n掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。n熟悉常用培养基的种类及用途熟悉常用培养基的种类及用途（一）培养基的制备（一）培养基的制备二二.实实 验验 原原 理理1.培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。不同微生物对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的因营养：碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的

4、氧化还原电位及合适的渗透压。培养基培养基n培养基：培养基：是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养材料。生代谢产物用的混合营养材料。n营养配置要求营养配置要求：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水等浓度适宜、配比适宜水等浓度适宜、配比适宜n物理化学条件物理化学条件：适宜的培养基：适宜的培养基pHpH值、值、一定的渗透压、一定的渗透压、一定的水活度和氧化还原电势等一定的水活度和氧化还原电势等培养基的分类培养基的分类n根据根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以微生物的种类和实验目的的不同

5、，培养基分类可以按以下方式按以下方式：n按按成分成分的不同分的不同分n按培养基的按培养基的物理状态物理状态分分n按培养基的按培养基的用途用途分分按照培养基的成分来分按照培养基的成分来分n天然培养基天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质主要成分是复杂的天然有机物质n合成培养基合成培养基:用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基成的培养基n半合成培养基半合成培养基:以天然有机物作为微生物营养来源的同时，以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基按照培养基的物理状态按照

6、培养基的物理状态n固体培养基固体培养基：加入凝固剂，：加入凝固剂，如如1.5%2.0%琼脂琼脂n半固体培养基半固体培养基：加入少量凝固剂，如：加入少量凝固剂，如 0.2%0.5%琼脂琼脂n液体培养基液体培养基：不含任何凝固剂：不含任何凝固剂按照培养基的用途分按照培养基的用途分v基础培养基：基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细菌生长。可供大多数细菌生长。v营养培养基（加富培养基营养培养基（加富培养基）v鉴别培养基鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生物在：含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后这种培养基上培养后，产生，

7、产生的某种代谢产物与这种特的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根根据反应结果可以据反应结果可以将某种微生物与他种微生物区别开来。将某种微生物与他种微生物区别开来。v选择培养基选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感性不：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。或鉴别某种微生物的目的。培养基灭菌培养基灭菌n配制培养的各类营

8、养物质和容器等含有各种微生物配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物n微生物生长繁殖：微生物生长繁殖：n 消耗消耗养分养分n 改变培养的酸碱度改变培养的酸碱度n 产生毒素或者抑制物产生毒素或者抑制物细菌：细菌：pH 7.08.0放线菌：放线菌：pH 7.58.5酵母菌：酵母菌：pH 3.86.0霉菌：霉菌：pH 4.05.8藻类：藻类：pH 6.07.0原生动物：原生动物：pH 6.08.0初始初始pHpH通常培养条件：通常培养条件：琼脂是最优良的凝固剂，自琼脂是最优良的凝固剂，自18801880年开始用于配制微年开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。生物培养基以来，至今经久不衰。实

9、验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌：查氏合成培养基；查氏合成培养基；操作步骤操作步骤1.1.称量称量2.2.溶化溶化3.3.补足水分，调补足水分，调pHpH4.4.（过滤）（过滤）5.5.分装分装6.6.加塞加塞7.7.包扎包扎8.8.灭菌灭菌9.9.搁置斜面搁置斜面10.10.无菌检查无菌检查1.1.称量称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏）

10、，应用烧杯称量。是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤2.2.溶化溶化 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的溶化时，需不断搅拌，如是配制固体培养基，在琼脂的溶化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全溶化后，补足并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全溶化后，补足所失水分。所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后在火上加热搅拌，然后加

11、足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。补足所失水分。培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤3.3.调节调节pHpH值值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用培养基溶解均匀并冷却至室温时用pHpH试纸测试纸测pHpH，然后根，然后根据要求加酸或碱（一般用据要求加酸或碱（一般用1molHcl1molHcl和和1molNaOH1molNaOH），要缓慢少量），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然且多加搅拌。培养基配方为自然pHpH时，不用调节。时，不用调节。4.4.过滤过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。培养基配制的基本步骤培养基配制的基

12、本步骤5.5.分装分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：装量可分为下面几方面：（1 1）斜面：装量为管长的）斜面：装量为管长的1/4-1/51/4-1/5。（2 2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的超过管长的1/31/3。（3 3）三角瓶：装量不超过容积）三角瓶：装量不超过容积1/21/2

13、。培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤6-8.6-8.加塞，包扎，灭菌加塞，包扎，灭菌 塞棉塞或橡胶塞，用牛皮纸包扎严实，放入高压锅中塞棉塞或橡胶塞，用牛皮纸包扎严实，放入高压锅中进行灭菌。进行灭菌。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于水的沸点升高，从而获得高于100100度的蒸汽温度。度的蒸汽温度。培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤9.9.搁置斜面搁置斜面 当培养基冷却至当培养基冷却至5050左右时，将

14、试管带棉塞的一端搁左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。的长度不超过试管总长的一半。培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤10.10.无菌检查无菌检查 培养基配置完成后。等待其冷却至室温然后放于培养基配置完成后。等待其冷却至室温然后放于4 4冰冰箱，第二日需要进行无菌检查。箱，第二日需要进行无菌检查。三三.操作步骤及本次实验具体安排操作步骤及本次实验具体安排培养基配制的基本步骤培养基配制的基本步骤1 1、固体培养基（平板制作）、固体培养基（平板制作）2 2、固体培养基（斜面制

15、作）、固体培养基（斜面制作）2 2、半固体培养基、半固体培养基3 3、液体培养基、液体培养基（一）平板固体培养基制作（一）平板固体培养基制作 1.1.称取一定量的称取一定量的营养琼脂营养琼脂到到250ml250ml的三角瓶中的三角瓶中.2.2.加入加入100mL100mL水水.3.3.塞上硅胶塞塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好用牛皮纸包扎好;4.4.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 5.5.灭菌后灭菌后,当培养基冷却至当培养基冷却至5050左右时左右时,倾注平皿倾注平皿(每每100ml100ml可制备可制备5-65-6个平皿个平皿)6.6.凝固后放冰箱备用凝固后放冰箱备用 （二）斜面培养基制作（二）斜面培养

16、基制作1.1.称取一定量的称取一定量的营养琼脂营养琼脂到到100ml100ml的三角瓶中的三角瓶中.2.2.加入加入100mL100mL水水.3.3.放入水浴锅内或放在电热炉上溶解放入水浴锅内或放在电热炉上溶解.4.4.在空试管内倒入在空试管内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意注意尽量不要让培养基沾到试管口尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞.5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌.6.6.摆斜面摆斜面,凝固后放冰箱备用凝固后放冰箱备用.用于活化菌种，或培养菌种的斜面用于保存菌种的斜面（三）半固体培养基制作（三）半固体培养基制作1.

17、1.按牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方称取相应成分到按牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方称取相应成分到250ml250ml的的三角瓶中三角瓶中.2.2.加入加入100mL100mL水水.3.3.放入水浴锅内溶解放入水浴锅内溶解.4.4.在空试管内倒入在空试管内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意尽量注意尽量不要让培养基沾到试管口不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞.5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌.6.6.凝固后放冰箱备用凝固后放冰箱备用.（四）液体培养基制作（四）液体培养基制作1.1.按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到按牛肉膏蛋白胨

18、液体培养基配方称取相应成分到250ml250ml的三的三角瓶中角瓶中.2.2.加入加入100mL100mL水水.3.3.充分溶解充分溶解.4.4.在空试管内倒入在空试管内倒入2 23mL3mL已经溶解好的培养基，已经溶解好的培养基，【注意尽量注意尽量不要让培养基沾到试管口不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞塞好硅胶塞.5.5.放入烧杯中放入烧杯中,高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌.6.6.冷却后放冰箱备用冷却后放冰箱备用.各组任务：各组任务：第第1-41-4组配制固体培养基，制平板；组配制固体培养基，制平板；第第5.65.6组配制固体培养基，制斜面；组配制固体培养基，制斜面；第第7,87,8组配制半固体

19、培养基；组配制半固体培养基；第第9,109,10组配制液体培养基。组配制液体培养基。n任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。n常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。n本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，

20、它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。灭菌的。（二）培养基的灭菌（二）培养基的灭菌高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 一般培养基一般培养基:1.05 Kg/cm 1.05 Kg/cm2 2,121.3,15-30 min,121.3,15-30 min 含糖培养基含糖培养基:0.56 Kg/cm 0.56 Kg/cm2 2,112.6,15-30 min,112.6,15-30 min 培养基的灭菌培养基的灭菌器皿的灭菌：器皿的灭菌：干热空气：干热空气：160160，2 2 小时小时无菌室的消毒：无菌室的消毒：紫外光紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；

21、高锰酸钾化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）甲醛）灭菌锅湿热灭菌使用的设备湿热灭菌使用的设备 操作过程操作过程 加水加水装锅装锅盖盖盖盖加热加热当压力升为当压力升为0.5kg/cm20.5kg/cm2时排放冷空气时排放冷空气正式升压正式升压保压（保压（1.1kg/cm21.1kg/cm2，121121，保，保持持20-30min20-30min）停止加热停止加热自然降压至零自然降压至零排放余汽排放余汽开开盖盖取出灭菌物品取出灭菌物品趁热摆斜面趁热摆斜面检验灭菌效果。检验灭菌效果。思考题思考题n 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若若不能及时灭菌应如何处理不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如已灭菌的培养基如何进行无菌检查何进行无菌检查?实实 验验 报报 告告三次实验后上交三次实验后上交