基因表达系统大肠杆菌表达系统 .ppt

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1、第第2节节 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统1 IL 11 MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVAPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL 1)1)分子量、等电点分子量、等电点2)2)信号肽信号肽3)3)糖基化糖基化4)4)蛋白酶裂解位点蛋白酶裂解位点5)5)有无二硫键（根据有无

2、二硫键（根据C C的数量的数量初步初步判断）判断）1 了解要目的基因蛋白质的一级结构了解要目的基因蛋白质的一级结构http:/www.expasy.ch23分子量、等电点分子量、等电点4信号肽信号肽56糖基化糖基化7蛋白酶裂解位点蛋白酶裂解位点82 分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点的限制性内切酶位点 atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgg

3、gccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggc

4、acc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg9http:/www.restrictionmapper.org/10113 选择合适的表达系统选择合适的表达系统查看表达载体图谱及

5、特性查看表达载体图谱及特性插入位点是否合适插入位点是否合适融合标签是否合适融合标签是否合适121314目的基因(IL 11)引物设计 xxxxxx atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg ga

6、ccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg ccccc

7、gctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg xxxxxx 15cDNAPCR EcoRIXhoIPCR扩增基因扩增基因RNA16PCRPCR技术克隆基因技术克隆基因17PCR反应组分反应组分94 C 294 C 3055 C 4572 C 172 C 1050l volumeDistilled Water X l 10X buffer 5 l 2.5 mM dNTP 4 l 25 Mm

8、MgCl2 3 l Template 1 l Forward Primer 1 l Reverse Primer 1 l Taq 酶酶 0.25 l 加热盖加热盖3518酶切反应酶切反应1l 10 x buffer（H，M，L）1 l 限制性内切酶限制性内切酶4 l DNA (PCR产物产物,质粒质粒)4 l 灭菌水灭菌水Mix37，1-2 h19琼脂糖电泳检测质粒是否切开琼脂糖电泳检测质粒是否切开20纯化酶切后的纯化酶切后的PCR产物、质粒产物、质粒酚氯仿抽提酚氯仿抽提,或用或用kit纯化纯化酚/氯仿抽提法纯化DNA的步骤如下：1、向酶切样品中加入灭菌水至总体积为100 L；2、加入等体积的

9、酚/氯仿，涡漩；3、10,000 rpm，5min；4、转移上清至新的离心管中（应避免吸取中间层的蛋白）；5、加入上清体积1/10的3M乙酸钠（pH5.2）和两倍总体积的100的乙醇，冰浴30 min。6、4离心，10,000 rpm，10 min；7、去上清，加100 L 70乙醇，洗涤沉淀；8、10,000 rpm 离心2 min，去乙醇；9、再离心1 min，去乙醇；10、真空干燥，完全去除乙醇以后，重溶于10 L灭菌水中，20保存，备用。21连接反应连接反应 10 lX l 载体载体X l DNAX l ddWater1l 10X T4 连接酶连接酶buffer1l PEG1l T4

10、DNA连接酶连接酶22质粒提取、酶切质粒提取、酶切连接、转化克隆质粒连接、转化克隆质粒23转化宿主细胞转化宿主细胞1 l重组载体重组载体+10 l水水50 l感受态细胞（冰浴中）感受态细胞（冰浴中）冰水中冰水中30 min42水浴水浴75 sec加入加入1 ml LB液体培养基液体培养基混匀混匀,37水浴，水浴，1 h6,000 rpm，2 min 去掉大部分上清液去掉大部分上清液留留100 l左右左右,悬起细胞悬起细胞涂平板涂平板 37 ，倒置平板过夜，倒置平板过夜24挑选菌落挑选菌落,保种保种,PCR检测检测,或测序或测序251.1.大大肠肠杆杆菌菌染染色色体体DNADNA分分子子量量很很

11、大大。在在提提取取质质粒粒过过程程中中，染染色色体体DNADNA往往往往断断裂裂成成线线状状大大分分子子；质质粒粒的的分分子子量量较较小，是共价闭合环状的超螺旋小，是共价闭合环状的超螺旋DNADNA。2.2.当当细细胞胞用用碱碱裂裂解解时时(pH(pH l2.012.6)l2.012.6)，线线状状DNADNA发发生生变性，共价闭环的质粒变性，共价闭环的质粒DNADNA不发生变性。不发生变性。3.3.在在高高盐盐浓浓度度下下将将裂裂解解液液pHpH恢恢复复至至中中性性时时，变变性性了了的的染染色色体体DNADNA交交织织成成网网状状而而发发生生沉沉淀淀，可可以以用用离离心心的的方方法法除除去去

12、染染色色体体DNADNA沉沉淀淀物物。共共价价闭闭环环的的质质粒粒DNADNA不不发发生沉淀生沉淀,留在离心上清液中。留在离心上清液中。4.4.用有机溶剂沉淀出质粒用有机溶剂沉淀出质粒DNADNA。提取质粒原理及方法提取质粒原理及方法261.培养细胞培养细胞,加抗生素加抗生素2.收集细胞收集细胞,14,000 g,1 min.3.悬浮细胞悬浮细胞 于 0.3 ml of Solution I 15 mM Tris-HCl(pH 8.0),10 mM EDTA,100 g/ml RNase A.碱变性碱变性 Add 0.3 ml of Solution II(0.2 N NaOH,1%SDS),

13、gently mix,Incubate at room temperature for 5 min.Note:The appearance of the suspension should change from very turbid to almost translucent.274.高盐、复中高盐、复中，Slowly add 0.3 ml of 3 M potassium acetate(pH 5.5),mixing gently during addition.A thick white precipitate of protein and E.coli genomic DNA wil

14、l form.Place the sample on ice for 5 to 10 min.5.离心离心 Centrifuge for 10 min at 14,000 g.286.沉淀沉淀 Gently transfer the supernatant to the tube containing isopropanol.Avoid any white precipitate material.Mix by gently inverting tube a few times and place on ice for 5 to 10 min.7.收集收集DNA，Centrifuge the

15、sample for 15 min at 14,000 g at room temperature.298.洗涤洗涤,70%ethanol to each tube.Invert the tube several times to wash the pellet.Centrifuge for 5 min at 14,000 g at room temperature.9.去上清液去上清液10.风干风干 5 to 10 min at room temperature and dissolve the DNA in 40 l TE.30SDS-PAGE检测表达情况检测表达情况试表达试表达31cDN

16、APCR EcoRI/XhoI双酶切双酶切pBR322 oripGEX 4T14900bpEcoR IXho IBal I纯化纯化纯化纯化EcoRIXhoIHHR3pGEX 4T14900bpT4DNA连接酶连接酶RNA32工作进程工作进程第一天,PCR扩增基因 摇质粒菌第二天,提质粒 纯化PCR产物和质粒 酶切,纯化 连接第三天,转化第四天,挑菌株检测,保种 过夜培养第五天,转培养,诱导表达第六天,SDS-PAGE 检测 3334 各种类型原核表达系统的构成和特点各种类型原核表达系统的构成和特点融合表达融合表达 外源基因与载体上的一段蛋白质编码基因形成一个外源基因与载体上的一段蛋白质编码基因

17、形成一个读框读框,表达出融合蛋白表达出融合蛋白 融合表达特别注意：融合表达特别注意：*表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！*如果表达后要切去标签，需要在构建载体前检查目如果表达后要切去标签，需要在构建载体前检查目 的蛋白中有无相同的蛋白酶裂解位点。的蛋白中有无相同的蛋白酶裂解位点。35pGEXpGEX 2T复制子复制子筛选标记筛选标记可控启动子可控启动子终止子终止子多克隆位点多克隆位点谷胱甘肽巯基转移谷胱甘肽巯基转移酶基因酶基因(GST),外源外源基因与基因与GST融合表融合表达成为一个杂和蛋达成为一个杂和蛋白。白。可以用蛋白酶切下可以用蛋白酶切下来。来。36pET 表达载体表达载体His Tag3738非融合表达非融合表达 独立的外源基因表达独立的外源基因表达,更接近天然的蛋白更接近天然的蛋白质质3940416大肠杆菌表达系统的问题大肠杆菌表达系统的问题7缺点缺点 1）缺乏翻译后修饰，如糖基化）缺乏翻译后修饰，如糖基化 2）常形成包涵体）常形成包涵体，复性效果差复性效果差 3）蛋白质易被降解）蛋白质易被降解 4）内毒素难以除尽内毒素难以除尽优点优点 1）简单）简单,经济经济,快速快速 2）适合于制备抗体适合于制备抗体,供下游研究供下游研究42