基因工程菌苗研究的现状与发展 .ppt

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1、 第六章第六章基因工程菌苗研究的现状与发展基因工程菌苗研究的现状与发展（Statusanddevelopmentofgeneengineeringbacteriavaccine）第一节第一节概述概述（SectionIoutline）1883年年-1885年巴斯德（年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制备了减用理化和生物学方法制备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效

2、果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。病死率大幅下降。细细菌菌一一旦旦获获得得耐耐药药性性，存存在在与与细细菌菌染染色色体体、质质粒粒和和转转座座子子中中的的耐耐药药基基因因就就可可通通过过转转化化、转转导导、接接合合和和转转座座等等方方式式，将将抗抗性性基基因因传传播播到到其其他他敏敏感感菌菌，使使之之成成为为抗抗药药菌菌株株，给给临临床床传传染染病病的的治治疗疗带带来来困困难难。

3、据据WHO1996年年报报告告，全全球球每每年年死死亡亡约约5190万人，其中万人，其中1/3约约1730万死于传染病。万死于传染病。在在过过去去20年年中中，有有29种种新新传传染染病病出出现现。美美国国Satcher博博士士在在EmergingInfectiousDiseases杂杂志志创创刊刊刊刊号号列列出出自自1973年年以以来来鉴鉴定定的的主主要要传传染染病病或或病病原原体体22种种。近近年年鉴鉴定定的的新新病病原原体体和和疾疾病病鉴鉴定定年年份份依依次次列列于表于表6-1。表表6-1 6-1 新鉴定的病原体新鉴定的病原体 年份年份病原体病原体所致疾病所致疾病1975微小病毒微小病毒

4、B19（pawovirusB19）5号病，慢性溶血性贫血号病，慢性溶血性贫血中的再障危象中的再障危象1976隐孢子虫（隐孢子虫（cryptosporidium）隐孢子虫病，急性小肠隐孢子虫病，急性小肠结肠炎结肠炎1977埃博拉病毒（埃博拉病毒（ebolavirus）埃博拉出血热埃博拉出血热1977军团病杆菌（军团病杆菌（legionellapneumophila）军团病军团病1977汉坦病毒（汉坦病毒（hantsannvirus）肾综合症出血热肾综合症出血热1977弯曲杆菌（弯曲杆菌（campylobacter）空肠弯曲杆菌肠炎空肠弯曲杆菌肠炎1980人嗜人嗜T淋巴细胞病毒（淋巴细胞病毒（HT

5、LV-1）T细胞淋巴瘤白血病细胞淋巴瘤白血病1981葡萄球菌毒素（葡萄球菌毒素（toxinproducingaureus）中毒性休克综合症中毒性休克综合症1982大肠杆菌大肠杆菌O157：H7（E.coliO157:H7）出血性肠炎，溶血性尿出血性肠炎，溶血性尿毒综合症毒综合症1982HTLV-II毛皮样细胞白血病毛皮样细胞白血病1982伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）莱姆病莱姆病1983HIV艾滋病艾滋病1983幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）胃溃疡胃溃疡1988人疱疹病毒人疱疹病毒6型（型（HHV-6）突发性玫瑰疹突发性玫瑰

6、疹1989查菲氏欧利希氏体查菲氏欧利希氏体人欧利希氏病人欧利希氏病1989丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（hepatitisC）丙型肝炎丙型肝炎1990戊戊型肝炎病毒（型肝炎病毒（hepatitisE）戊型肝炎戊型肝炎1991Guonarito病毒病毒委内瑞拉出血热委内瑞拉出血热1992霍乱弧菌霍乱弧菌O139地方性流行性霍乱地方性流行性霍乱1992巴尔道氏体（巴尔道氏体（Bartonellahenselae）猫抓病、细菌性血管瘤病猫抓病、细菌性血管瘤病1992环形孢子环形孢子环形孢子虫病环形孢子虫病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒分离株汉坦病毒综合症汉坦病毒综合症1993Sinnombreviru

7、s1994Sabia病毒病毒巴西出血热巴西出血热1995庚型肝炎病毒（庚型肝炎病毒（hepatitisG）庚型肝炎庚型肝炎1995人疱疹病毒人疱疹病毒8型（型（HHV-8）卡波济肉瘤，淋巴瘤卡波济肉瘤，淋巴瘤1996朊病毒（朊病毒（prion）(BSE,TSE)传染性海绵状脑病，克雅病传染性海绵状脑病，克雅病1997TT病毒（病毒（TTVirus）TTV肝炎肝炎1999尼巴病毒（尼巴病毒（nipahvirus）发热性脑炎发热性脑炎1999伊氏埃立克体（伊氏埃立克体（Ehrlichiaewingii）人埃立克体病人埃立克体病 新新病病原原体体不不断断出出现现与与鉴鉴定定，新新的的疫疫苗苗研研制制

8、也也相相继继开开始。始。重重要要病病原原体体全全基基因因测测序序的的开开展展和和完完成成，及及类类似似生生物物表表型型的的不不同同菌菌属属间间的的同同源源序序列列和和异异源源序序列列的的发发现现，对对抗抗感感染染研研究究来来说说，像像进进行行了了一一场场革革命命，不不仅仅会会促促进进病病原原体体致致病病和和发发病病机机制制的的研研究究，也也会会开开阔阔和和调调整整菌苗研究的策略和思路。菌苗研究的策略和思路。目目前前已已完完成成500500余余种种病病毒毒的的全全基基因因测测序序，关关于于重重要要病原菌全基因测序进展情况列于表病原菌全基因测序进展情况列于表6-26-2。完成的完成的正在进行的正在

9、进行的将要进行的将要进行的流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）放线性放线菌放线性放线菌（Actinobacillusactinomycetemcomitans）弯曲杆菌（弯曲杆菌（Campylobacterjejuni）生殖道支原体生殖道支原体（Mycoplasmagenitolium）枸巢曲霉杆菌（枸巢曲霉杆菌（Aspergillusmidulans）流产布氏杆菌（流产布氏杆菌（Brucellaabortus）肺炎支原体肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae）枯草杆菌（枯草杆菌（Bacillussubtilis）杜克雷嗜血杆菌（杜克雷嗜血杆菌（

10、Haemophilusducreyi）幽门螺杆菌幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）沙眼衣原体（沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatio）鸟分枝杆菌（鸟分枝杆菌（Mycobacteriumavium）伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）粪肠球菌（粪肠球菌（Enterococcusfaecalis,E.faecium）多杀巴斯德菌（多杀巴斯德菌（Pasteurellamultocida）表表6-2 6-2 人类重要病原菌全基因测序现状人类重要病原菌全基因测序现状 E.coliK12军团菌（军团菌（Legionellapneumopbila）

11、牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingvalis）肺炎球菌肺炎球菌（Streptococcuspneumoniae）麻风分枝杆菌（麻风分枝杆菌（Mycobacterunleprae）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaserotypeTyphimurium）梅毒螺旋体（梅毒螺旋体（Treponemepallidun）淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriagonorrhoeae,N.meningitidis）布氏锥虫布氏锥虫（Trypanosomabrucei）解脲原体解脲原体（Ureoplasmaurealyticum）亚性疟（亚

12、性疟（plasmodiumfalciparum）痢疾杆菌痢疾杆菌（Shigella）绿脓杆菌（绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）大型利什曼原虫大型利什曼原虫（Leishmaniamajor）金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）霍乱弧菌（霍乱弧菌（Vibriocholerae）化脓链球菌（化脓链球菌（Streptococcuspyogenes）总之，已控制传染病的再现及新传总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必

13、要加快进行创新性的细菌因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。菌苗的研制与开发。第二节第二节目前应用的菌苗及其存在问题目前应用的菌苗及其存在问题Presentbacteriavaccineandthequestion一、目前应用菌苗的类别一、目前应用菌苗的类别Thetypeofbacteriavaccine按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即减毒减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖

14、与蛋白结菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗合菌苗。1、减毒的活菌苗（、减毒的活菌苗（Attenuatedbacteriavaccine）如卡介苗（如卡介苗（BCG），），是巴斯德研究院是巴斯德研究院Calmette和和Guerin等（等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油）将一株牛型强毒结核菌在甘油-胆胆汁汁-马铃薯培养基上传马铃薯培养基上传230代后（代后（13年），获得的对动年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对对免疫婴幼儿有保护效果。免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减后来发现对

15、成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行比较，方知比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。缺失了毒力相关基因。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。2、灭活菌苗、灭活菌苗（Deadbacteriavaccine）通过加热处理或福尔马林（通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、）、戊二醛（戊二醛（glutaraldehyde）、）、-内酯（内酯（-propiolactone）

16、等化学处理得到。如霍乱死菌）等化学处理得到。如霍乱死菌苗、百日咳（苗、百日咳（Bordetellapertussis）死菌苗等。死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能得到好的保护效果。免疫才能得到好的保护效果。3 3、亚亚 单单 位位 或或 成成 分分 苗苗 （Subunitbacteriavaccine）从从细细菌菌培培养养液液中中提提取取、用用化化学学方方法法脱脱毒毒的的类类毒毒素素苗苗，如如破破伤伤风风类类毒毒素素（TTTT）、白白喉喉类类毒毒素素（DTDT），免免疫疫后后诱诱导导机机体体产产生生的的抗抗血血清清能能特特异异中中和和

17、TTTT破破伤伤风风类类毒毒素素或或DTDT白白喉喉类类毒毒素素，其其保保护护效效果果可可达达95%95%以以上上。由由于于毒毒素素纯纯化化方方法法的的改改进进，产品的副作用很小。产品的副作用很小。荚荚膜膜细细菌菌纯纯化化的的多多糖糖菌菌苗苗，可可诱诱导导产产生生的的抗抗体体能能保保护护机机体体抵抵抗抗入入侵侵荚荚膜膜菌菌的的感感染染。如如嗜嗜血血性性流流感感杆杆菌菌b（Hib）、伤伤寒寒杆杆菌菌Vi多多糖糖等等多多糖糖苗苗，能能诱诱导导机机体体产产生生T细细胞胞非非依依赖赖的的抗抗体体反反应应，其其特特点点是是诱诱导导产产生生短短期期的的IgM抗抗体体，缺缺乏乏免免疫疫记记忆忆，对对不不到到

18、18个个月月幼幼儿儿的的多多糖糖苗苗免免疫疫原原性性差差，而而没没有有保保护护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。效果。因此多糖类的菌苗急需改进。目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋白提供适当的白提供适当的白提供适当的白提供适当的T T细胞表位，由细胞表位，由细胞表位，由细胞表位，由T T细胞协助细胞协助细胞协助细胞协助B B细胞产生细胞产生细胞产生细胞产生多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使T T细胞非依赖性抗原转变为细胞非依赖性

19、抗原转变为细胞非依赖性抗原转变为细胞非依赖性抗原转变为T T细细细细胞依赖抗原，这类菌苗称为胞依赖抗原，这类菌苗称为胞依赖抗原，这类菌苗称为胞依赖抗原，这类菌苗称为多糖多糖多糖多糖-蛋白结合苗蛋白结合苗蛋白结合苗蛋白结合苗。如。如。如。如嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌HibHib的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，证明对不到证明对不到证明对不到证明对不到1818个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱导免疫

20、记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少成熟，明显减少成熟，明显减少成熟，明显减少HibHib菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。表表6-3 6-3 目前可用于人群的菌苗目前可用于人群的菌苗 菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内 国外国外1卡介苗（卡介苗（BCG）活菌苗活菌苗结核病结核病i.di.d2布氏病菌苗布氏病菌苗（104M）活菌苗活菌苗布氏菌病布氏菌病d.s3鼠疫菌苗鼠疫菌苗（EV）活菌苗活菌

21、苗鼠疫鼠疫d.s4炭疽菌苗炭疽菌苗（A16R,CTN-1,V770-NP-1）活芽胞苗活芽胞苗炭疽炭疽d.s炭疽菌苗炭疽菌苗灭活菌苗灭活菌苗炭疽炭疽s.c菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外5百日咳菌苗百日咳菌苗类毒素类毒素灭活菌苗灭活菌苗百日咳百日咳炭疽炭疽i.mi.m6脑膜炎球菌苗（脑膜炎球菌苗（A、C群）群）多糖成分多糖成分脑膜炎脑膜炎i.ms.c7脑膜炎球菌苗脑膜炎球菌苗（A/C/Y/W-35群）群）多糖成分多糖成分脑膜炎脑膜炎s.c8流脑流脑A群多糖群多糖-破伤风破伤风蛋白结合菌蛋白结合菌苗苗多糖多糖-蛋白结蛋白结合苗合苗流行性脑脊流行性脑脊髓膜炎髓膜炎i.m9伤寒菌

22、苗（伤寒菌苗（Ty21a）伤寒菌苗（伤寒菌苗（Ty21a）伤寒伤寒Vi多糖苗多糖苗活菌苗活菌苗灭活全菌苗灭活全菌苗多糖成分多糖成分伤寒伤寒伤寒伤寒伤寒伤寒i.mp.os.ci.m10精制破伤风菌苗精制破伤风菌苗类毒素类毒素破伤风破伤风i.mi.m11精制白喉菌苗精制白喉菌苗类毒素类毒素白喉白喉i.m菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外12白白-百百-破三联苗破三联苗（DTP）类毒素类毒素白喉，百日咳白喉，百日咳i.m灭活全苗灭活全苗破伤风破伤风i.m13白白-破破-百三联百三联（DTaP）类毒素类毒素白喉，百日咳白喉，百日咳i.m白白-破破-百三联苗百三联苗灭活全苗灭活全苗破伤

23、风破伤风i.m14白白-破二联苗（破二联苗（DT或或Td）类毒素类毒素白喉，破伤风白喉，破伤风i.mi.m15钩端螺旋体菌苗钩端螺旋体菌苗外膜成苗外膜成苗钩端螺旋体病钩端螺旋体病s.c16霍乱弧菌（霍乱弧菌（O139）灭活全菌灭活全菌苗苗霍乱霍乱s.cS,c/i.d17CVD103HgR基因工程基因工程活苗活苗霍乱霍乱p.o18肺炎球菌（肺炎球菌（23型）型）多糖成分多糖成分肺炎肺炎p.o菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外19嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型型（Hib）类毒素类毒素脑膜炎脑膜炎i.m20DTP-嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型结合苗型结合苗灭活的全菌灭活的全菌苗苗白喉

24、，百日白喉，百日咳，咳，i.m（DTP-Hib）细菌多糖细菌多糖-蛋蛋白结合菌苗白结合菌苗破伤风，脑破伤风，脑膜炎膜炎i.m21福氏福氏2a与宋内双价痢与宋内双价痢疾菌苗（疾菌苗（FSM2117）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.oF2a与宋内双价痢疾与宋内双价痢疾菌苗（菌苗（FS）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.o22莱姆病菌苗（莱姆病菌苗（OspA）重组重组OspA莱姆病莱姆病s.c注：注：i.d皮内，皮内，s.c皮下，皮下，d.s划痕，划痕，i.m肌注，肌注，p.o口服口服（二）研制菌苗的新方法（二）研制菌苗的新方法（Newmethodofproducebacteriavaccin

25、e）1 1、研制菌苗的新方法（、研制菌苗的新方法（newmethods）对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不断设计和研制新型疫苗的重要基础。断设计和研制新型疫苗的重要基础。针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型

26、的菌苗。目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表6-46-4 。表表6-4目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗1纯化亚纯化亚单位成单位成份份嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（H.influenze）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）（N.meningitidia）百日咳菌血凝素（百日咳菌血凝素（Hemagglutinin）2合成肽合成肽淋球菌（黏附菌毛）（淋球菌（黏附菌毛）（N.gonorihoeae,Adhernce-pili）肺炎链球菌（肺炎链球菌（Streptococcus）3

27、核酸疫核酸疫苗苗结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（M.tuberculosis）产单核细胞李斯特菌（产单核细胞李斯特菌（L.monocytogenes）沙眼衣原体（沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatio）伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）4构建突变株构建突变株（化学、辐射、点突变（化学、辐射、点突变或转座子插入等）或转座子插入等）伤寒菌苗伤寒菌苗Ty21a（S.typhi,Ty21a）霍乱菌苗（霍乱菌苗（V.Cholerae）CVD103HgRETEC苗苗5与与CT-B，LT，TT，DT等化学结合等化学结合伤寒伤寒Vi抗原抗原痢疾菌苗痢疾菌苗,嗜血流感

28、杆菌苗嗜血流感杆菌苗6构建重组细菌载体构建重组细菌载体重组病毒载体重组病毒载体HbsAg肠沙门氏菌载体肠沙门氏菌载体宋内氏痢疾菌宋内氏痢疾菌LPS痢疾菌载体痢疾菌载体痢疾多价菌苗痢疾多价菌苗耶尔森氏菌载体耶尔森氏菌载体BCG载体载体幽门螺杆菌溶酶素幽门螺杆菌溶酶素腺病毒载体腺病毒载体霍乱菌载体霍乱菌载体2、目前菌苗存在的问题（、目前菌苗存在的问题（questions）（1）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，但小于但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。目仍然很高。如疟疾几种腹泻病等均无有如疟疾几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（

29、效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十年使用几十年了，甚至纳入了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其效的计划免疫，但其效果波动很大果波动很大0%80%，因此急需安全有效，因此急需安全有效的结核菌苗问世。的结核菌苗问世。（2 2）与病毒相比）与病毒相比：基基因因工工程程细细菌菌及及细细菌菌核核酸酸苗苗报报导导明明显显少少。至至今今国国际际上上还还没没有有成成功功满满意意的的重重组组细细菌菌苗苗提提供供人人群群使使用用。关关于于细细菌菌毒毒素素的的分分子子及及其其编编码码基基因因与与调调控控机机制制都都比比较较清清楚楚，因因此此，有有关关毒毒素素的的基基因因工工程程菌菌苗苗的的构构建建或或载载体体构构建

30、建等等均无问题。均无问题。但但菌菌外外膜膜上上的的其其它它结结构构如如粘粘附附分分子子，侵侵袭袭蛋蛋白白，鞭鞭毛毛及及脂脂多多糖糖等等分分子子结结构构十十分分复复杂杂，编编码码基基因因多多呈呈丛丛分分布布，如如LPSLPS的的表表达达涉涉及及近近3030个个基基因因的的级级联联反反应应，操操作作起起来来尚尚有有困困难难。因因此此还还有有毒毒力力相相关关或或保保护护相相关关基基因因的的分分离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做（三）理想菌苗的条件（三）理想菌苗的条件（Idealbacteriavaccinescondition）理想疫苗应该是

31、：理想疫苗应该是：（1 1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。性，无致畸变或致流产性。（2 2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。（3 3）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。（4 4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。（5 5）能口服，能有效诱导粘膜免疫。）能口服，能有效诱导粘膜免疫。（6 6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。）易于生产，储存

32、及服务，不需冷藏。每每一一项项要要求求，都都需需要要大大量量的的基基础础研研究究，已已能能提提出出更更为为合合理理的的疫疫苗苗研研究究策策略略，研研制制出出安安全全高高效效，使使用方便，价格低廉的菌苗用方便，价格低廉的菌苗 第三节第三节重要细菌基因工程苗的研究进展重要细菌基因工程苗的研究进展（Developmentofimportantgeneengineeringbacteriavaccine)当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：要细菌感染性疾病的问题有：现有菌苗保护效果不好；现有菌苗保护效果不好；副反应大；副反应大；难以

33、培养的细菌；难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症；可诱发癌变，有严重后遗症；新出现的病原体或新变异病原菌。新出现的病原体或新变异病原菌。一、霍乱菌苗一、霍乱菌苗 (Choleravaccine)霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CTCT）引起腹泻及其他症状。引起腹泻及其他症状。已已知知有有O O抗抗原原，毒毒素素共共调调节节菌菌毛毛（TCPTCP），血血凝凝素素（HAHA），外外膜膜蛋蛋白白（OMPsOMPs）等等，及及引引起起水水样样腹腹泻泻的的霍霍乱乱毒毒素素（CTCT）由由A

34、B5AB5的六聚体构成。的六聚体构成。霍霍 乱乱 产产 毒毒 株株 ctxABctxAB的的 5 5端端 有有 一一 6kb6kb的的 DNADNA，依依 次次 有有20t,ace,orfu,cep20t,ace,orfu,cep和和RSRS序序列列与与ctxABctxAB一一起起称称为为霍霍乱乱毒毒素素元元件件（CTXCTX）元元件件，可可进进行行转转移移，与与一一种种丝丝状状噬噬菌菌体体（CTXCTX）有有关关，而非产毒株没有这段而非产毒株没有这段DNA DNA。据菌体抗原霍乱弧菌可分为据菌体抗原霍乱弧菌可分为200200个以上的血清型个以上的血清型1881-18961881-1896年间

35、的年间的5 5次及次及1899-19231899-1923年的第年的第6 6次大次大流行均由流行均由O1O1群古典型霍乱弧菌引起。群古典型霍乱弧菌引起。第第7 7次大流行自次大流行自19611961年延续至今，波及五大洲年延续至今，波及五大洲19921992年出现了一新的流行株年出现了一新的流行株O139O139血清型霍乱血清型霍乱目前流行的霍乱为目前流行的霍乱为O1O1和和O139O139两种血清型。两种血清型。近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：1.1.BS/WC灭活菌苗灭活菌苗(BS/WCdeadbacteriavaccine）由由提提取取的的或或重重组组的的

36、霍霍乱乱毒毒素素B B亚亚单单位位（BSBS）及及杀杀死死的的全全菌细胞（菌细胞（WCWC）组成。组成。2.2.CVD103-HgR减毒活菌苗（减毒活菌苗（Levine1998）在在美美国国获获准准，为为一一次次剂剂量量的的霍霍乱乱活活菌菌苗苗。它它是是由由霍霍乱乱经经典典型型569B569B菌菌株株构构建建而而成成的的CVD103CVD103减减毒毒株株（CTACTA-B B+）。并并在在其其染染色色体体溶溶血血素素基基因因nlyAnlyA位位点点插插入入汞汞抗抗性性基基因因作作为为筛筛选选标标记。记。3.3.以以沙沙门门氏氏菌菌为为载载体体表表达达霍霍乱乱弧弧菌菌O O抗抗原原的的伤伤寒寒

37、/霍霍乱乱双双价价菌苗。菌苗。4.4.O139减毒菌苗候选株减毒菌苗候选株CVD112及及Bengal-15 表表6-5 6-5 重组霍乱菌苗的特性重组霍乱菌苗的特性 菌菌苗苗株株亲株（生亲株（生物型，血物型，血清型）清型）特性特性口服口服副反副反应应a a定居率定居率（%）b b保护率保护率（%）c c攻击苗攻击苗排菌率排菌率（%）d d作者作者JBJBK7K70 0NI NI 6961(E1T6961(E1Tor,Inabaor,Inaba)ctxAB,ctxAB,HgHgr r中等中等10010090902020KaperKaper et et al.(1984)al.(1984)CVC

38、VD1D10202O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxActxA,胸腺嘧胸腺嘧啶营养啶营养缺陷型缺陷型无无4040N.DN.Df fN.DN.DLevine et Levine et al(1988b)al(1988b)CVCVD1D10505O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxActxA,hlyAhlyA中等中等100100N.DN.DN.DN.DLevine et Levine et al(1988b)al(1988b)CVD103CVD103-HgR-HgR 569B(Ca569B

39、(Cassical,ssical,Inaba)Inaba)ctxActxA hlyA:merhlyA:mer 无无 28 28 100(Class100(Classical)63(Eical)63(EI I TorTor)2929（ClassClassicalical）83(83(EI EI ToxTox)Levine Levine et al et al(1988a(1988a PERU-3 PERU-3 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inababa)attRSIattRSI reca:htpreca:htpG-ctxBG-ctxB StrStrr r 轻轻微

40、微 83 83 87 87 N.AN.Ae e Taylor Taylor erer al al(1994)(1994)PERU-PERU-14 14 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inababa)attRSIattRSIrecA:hrecA:htpG-ctxBtpG-ctxB StrStrr r,丝状，丝状，缺乏制动缺乏制动性性 无无 100 100 80 80 N.A N.A TaykorTaykor et al et al(1994)(1994)PERUPERU-15-15C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InTor,Inabaaba)att

41、RSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxBctxB StrStrr r，无制无制动性动性无无828260608080Kenner Kenner et et a(1995a(1995)BENGBENGAL-AL-1515MO10(OMO10(O139)139)attRSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxBctxB StrStrr r，无制无制动性动性无无909083834242CosterCoster et al et al(1995)(1995)a a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热挛，厌食

42、，发热b b服苗者粪便中排菌苗株的百分率服苗者粪便中排菌苗株的百分率c c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率d d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率霍乱弧菌的百分率e e未得到数据未得到数据f f未做未做 另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgAsIgA及血清及血清IgGIgG反应，及黏膜免疫记忆反应，对反应，及黏膜免疫记忆反应，对CTCT及及CTBCTB的免疫佐剂活性进行了大量的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒

43、、的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见表识。进展情况见表6-66-6。表表6-6 CT/CT-B6-6 CT/CT-B佐剂应用的抗原佐剂应用的抗原 抗原（佐剂）抗原（佐剂）途径途径参考文献参考文献蛋白质蛋白质破伤风类毒素（破伤风类毒素（CTCT）p.op.o（Jackson et al,1993Jackson et al,1993）链球菌链球菌M M蛋白（蛋白（CT-BCT-B）i.mi.m（BessenBessen and and Tischetti,1988Tischetti,1988）链球菌链球菌（CT-BCT-B

44、）S.MutansS.Mutans抗原抗原I/III/II（CT/CT-BCT/CT-B）p.op.o（CzerkinskyCzerkinsky et al,1989;Wu et al,1989;Wu and Rusell,1993and Rusell,1993）S.MutansS.Mutans蛋白质抗原（蛋白质抗原（CT-BCT-B）流感病毒溶血素（流感病毒溶血素（CT/CT-BCT/CT-B）i.mi.m(Takahashi et al.,1990)(Takahashi et al.,1990)呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒FGFG糖蛋白（糖蛋白（CT/CT-CT/CT-B B）p.o,i.

45、m p.o,i.m（TomasiTomasi et al,1994 et al,1994）S.mutansS.mutans Gtf.1 Gtf.1：phopho A A融合蛋白融合蛋白 i.mi.m（Walsh,1993Walsh,1993）多糖多糖p.op.o(TomasiTomasi et al,1994)et al,1994)沙门氏菌多糖（沙门氏菌多糖（CT-BCT-B）p.op.o（Orr et al.,1994Orr et al.,1994）P Paeruginosaaeruginosa多糖（多糖（CTCT）p.op.o（Abraham and Abraham and Pobinso

46、n,1991Pobinson,1991）病毒病毒 完整流感病毒（完整流感病毒（CTCT）p.op.o(Chen and(Chen and StroberStrober 1990)1990)仙台病毒（仙台病毒（CTCT）p.o,i.p.o,i.m m（NedrudNedrud et al.1987 et al.1987）NeaslesNeasles病毒（病毒（CT-BCT-B）i.ni.n(Muller et al,1995)(Muller et al,1995)呼吸道合胞病毒（呼吸道合胞病毒（RSVRSV）i.ni.n(ReumanReuman et al,1991)et al,1991)细菌

47、细菌/原生动物原生动物 幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（CTCT）p.op.o(CzinnCzinn and Nedrud,1991)and Nedrud,1991)弓形体（弓形体（CTCT）p.o p.o（BourguinBourguin et al.,1991 et al.,1991）阿米巴原虫多肽阿米巴原虫多肽-CT-B-CT-B融合蛋白融合蛋白 p.o p.o(Zhang et al,1995b)(Zhang et al,1995b)二、痢疾菌苗（二、痢疾菌苗（Dysenteryvaccine）痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居始终居2424种法定传

48、染病的前二位。种法定传染病的前二位。主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆噬泡膜进入胞浆.临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。重，甚至引起神经症状和血尿综合症。痢痢疾疾菌菌共共有有4 4群群：A A志志贺贺氏氏痢痢疾疾菌菌（ShigellaShigella dysenteriaedysenteriae），B B福福氏氏痢痢疾疾菌菌（S.flexneriS.flexneri），C C鲍鲍氏氏痢痢疾疾菌菌（

49、S.bordiiS.bordii）和和D D宋宋内内氏氏痢痢疾疾菌菌（S.sonneiS.sonnei）。）。按其菌膜表面按其菌膜表面LPS-OLPS-O抗原分为抗原分为4444个血清型。个血清型。目目前前已已知知至至少少2727个个基基因因和和1515个个蛋蛋白白与与痢痢疾疾菌菌入入侵侵宿宿主主细细胞胞相相关关，它它们们作作为为IIIIII型型分分泌泌系系统统的的调调节节子子与与效效应应子子，以以接接触触依依赖赖方方式式被被分分泌泌进进入入宿主细胞。宿主细胞。1.1.死菌苗（死菌苗（Deadbacteriavaccine）五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾五、六十年代大量动物及人体

50、实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，但没有保护效果；但没有保护效果；用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明LPS-OLPS-O多糖是保多糖是保护性抗原；护性抗原；Robbins(1992)Robbins(1992)将痢疾菌将痢疾菌LPSLPS与不同蛋白载体（与不同蛋白载体（TTTT，DTDT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一