基因工程药物干扰素的制备 .ppt

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1、中文名称：干扰素 英文名称：interferon;IFN 定义1：细胞因子中的一个家族，以干扰病毒复制而得名。根据产生细胞不同可分为干扰素、干扰素和干扰素三类。应用学科：免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科）定义2：脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质。可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而得此名。干扰素有型和型，以及干扰素样细胞因子，型干扰素有7种：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-、IFN-、IFN-和IFN-，人类没有IFN-和IFN-；型仅有IFN-。应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；激素与维生素（二级学科）定义3

2、：抑制病毒在细胞内增殖的一类活性蛋白质。应用学科：水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科）定义4：因最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种生物学活性物质可干扰另一种病毒的感染和复制而得名。是最早发现的细胞因子。根据干扰素产生的来源和结构不同可分为干扰素、干扰素和干扰素三类。应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科）干扰素概述干扰素概述干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干

3、扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素发现发展历程干扰素的生产企业干扰素的药理作用、临床应用及不良反应干扰素的制备路线50年前，英国的病毒学家艾力克伊萨克斯(Alick Isaacs)在流感病毒研究时发现，在鸡胚中注射灭活流感病毒后，鸡胚细胞中生成了一种物质，这种物质可以反过来“干扰(interfere)”流感病毒的生长，于是就将这种物质称为干扰素(interferon)。随着研究的深入，人们发现它是一个非常重要的细胞因子，不仅具有直接抗病毒作用，

4、更重要的是它还具有免疫增强作用。干扰素独具的双重作用让科学家们兴奋不已。显然它具备了成为攻克乙肝的利器的必要条件。但干扰素的人工合成、工业化生产乃至最后真正为攻克疾病作出贡献，又经历了漫长而艰辛的过程。一、干扰素的发现发展历程一、干扰素的发现发展历程早期的干扰素是从人体白细胞中通过纯化技术提取的，不仅量少，且含有很多杂质，导致作用有限。直到70年代中期，随着生物医学的发展和基因重组技术的出现，科学家们逐渐开始尝试通过基因重组技术合成干扰素。1978年，瑞士罗氏公司的科学家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干扰素cDNA，为后来干扰素的工业化生产奠定了基础。1990年，基因重组技术正式应用于干扰

5、素的工业化生产，于是今天所说的“普通干扰素”开始批量生产。但是，普通干扰素也给患者和医生带来困扰：它注射后吸收入血过快且从血液中清除过快会导致很大的血药浓度波动，浓度过高时会导致较为严重的不良反应，但浓度过低又会导致病毒重新复制和反弹；此外，一旦注射了普通干扰素，它广泛分布于全身，肾脏清除率很高，也极易被免疫系统识别其血清半衰期只有2至5小时，必须频繁注射用药，因而干扰素的临床应用受到了很大限制。到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技术的出现使干扰素终于成为人类与乙肝斗争中的真正利器。2002年，罗氏研究生产的聚乙二醇化干扰素-2a(派罗欣)正式上市，聚乙二醇与干扰素的结合，

6、大大改善了干扰素的药物特性，使血药浓度变得更加稳定，同时聚乙二醇分子支链对干扰素有效成分的保护作用，大大降低了它的抗原性，血清半衰期大大延长可以每周一次注射用药临床疗效得以明显提高，副反应显著减少。干扰素发现者Alick Isaacs 1957年，英国医生Alick Isaacs在进行流感病毒试验时，发现鸡胚中注射灭活流感病毒后生成了一种物质，这种物质具有“干扰”流感病毒感染的作用，于是Isaacs将这种物质称之为“interferon”，也就是今天我们所说的干扰素。干扰素抗病毒作用机理的发现者Robert M.Friedman 在1966到1971年期间，美国医生Robert M.Fried

7、man发现了干扰素对病毒的抑制作用主要是干扰素干扰了病毒信使RNA功能，而抑制了蛋白的合成。从此，关于干扰素抗病毒的作用机理的深入研究才被逐渐展开。干扰素从实验室到临床的重要人物Derek C.Burke 美国病毒学专家Derek C.Burke致力于干扰素的生产流程的研究，并在1980年实现了通过人类白细胞进行干扰素量化生产，虽然这种生产方式无法与基因技术出现后的生物工程生产方式相比，但对干扰素从实验室成功地走向临床却是有着非常重要的意义。干扰素免疫调节机制的证实者Samuel Baron 美国人Samuel Baron与Isaacs的共同研究证实了干扰素在机体免疫系统对抗病毒感染中的起着非

8、常重要的作用，也正是他们的研究为干扰素在临床的应用提供了更多的证据，并为干扰素抗病毒的双重作用机理奠定了基础。使干扰素的临床应用成为可能Sidney Pestka 美国科学家Sidney Pestka在罗氏研究院里成功克隆出了干扰素cDNA，为后来干扰素的工业化生产奠定了基础。上海生物制品研究所北京三元基因工程有限公司长春海伯尔生物技术有限责任公司深圳科兴生物工程有限公司哈药集团生物工程有限公司天津华立达生物工程有限公司沈阳三生制药有限责任公司安徽安科生物工程(集团)股份有限公司二、干扰素生产企业二、干扰素生产企业干扰素在病毒细胞表面与特殊膜受体结合发挥抗DNA和RNA作用，包括对某些酶的诱导

9、作用，阻止受病毒感染细胞中病毒的复制，抑制这些细胞的繁殖。本品具有免疫调节作用，可增强巨噬细胞的吞噬作用，增强淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性。1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。当病毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰素亦可缓解感染。2.抑制细胞增殖：干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大5001000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。3.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细

10、胞也有一定的免疫增强作用。三、干扰素药理作用三、干扰素药理作用干扰素防治感冒干扰素治疗非典(SARS)干扰素治疗慢性乙肝(CHB)干扰素治疗肿瘤干扰素治疗疱疹病毒感染干扰素对狂犬病毒的作用干扰素治疗亚急性硬化性全脑炎(SSPF)干扰素治疗多发性硬化(M S)及肌萎缩性侧索硬化临床应用临床应用1.全身反应：主要表现为流感样症状，即寒战、发热和不适。2.骨髓抑制：在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞减少。3.局部反应：部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，24h后即可消退。4.其他：脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前应做过敏试验。5.呼吸困难、肝功能降低、白细胞

11、减少、过敏反应、转氨酶和血肌酐升高、全身乏力、脱发、鼻塞、鼻出血、上皮萎缩、嗜睡甚至癫痫发作。6.罕见有抑郁、意识障碍、体重减轻、皮疹、秃发、给药局部反应、感觉异常、呼吸困难、单纯疱疹、眼痛、心动过速、焦虑、瘙痒、鼻出血、咳嗽、高血压、感觉减退、腹痛、咽炎等。7.心血管系统不良反应特别是心律失常似与原有心血管疾病及以前有心脏毒性的治疗有关。剂量大于每天1000万U时，出现肝功能指标AST、ALT上升，粒细胞和血小板计数减少，停药或减量时可迅速恢复。其他尚有白细胞减少和血清肌酐、LDH、碱性磷酸酯酶上升。不良反应不良反应不良反应不良反应处理好各种不良反应，包括必要时减量、对症处理或终止治疗。（1

12、）流感样症状的处理：发热时可给予乙酰氨基酚或其他解热镇痛药，干扰素用药时机掌握在就寝前或者傍晚给药或休息日给药；多饮水，吃平衡膳食。（2）头痛的处理：服用镇痛药，尽量避免强光和噪声，不饮酒、少食富含酷氨酸和苯丙氨酸的食物，限制咖啡因的摄入，保证每日足够睡眠及充足的水分。（3）发热、乏力、肌肉疼痛的处理：干扰素注射前口服对乙栈氨基酚，或其他非处方退热药，就寝前或者傍晚给药，使患者在睡眠中度地发热期；冷敷、热水浸泡或理疗、按摩。（4）失眠或兴奋的处理：保持良好的睡眠卫生习惯，规律的作息时间，睡前保持放松状态，有睡意时才睡觉，限制午睡时间；定期进行锻炼，限制咖啡因的乙醇的摄入。（5）脱发的处理：避免

13、用损发产品、电吹风机、束发带和每日洗发；使用柔和的洗发剂和护发剂；避免染发和烫发，留短发或者戴假发。（6）食欲减退的处理：保持良好的口腔卫生，适当的休息和锻炼；少量多餐，多食水果、蔬菜。（7）注射局部反应的处理：注射前冰敷注射部位至产生麻木感；注射部位消毒，待乙醇干燥后再注射；药物达到室温后注射，以4590进针；不要搓揉注射部位；交替部位注射。（8）抑郁症的处理：治前评估心理健康稳定性，预测治疗期间症状的强度，根据抑郁的严重程度，调整干扰素剂量或停止治疗，需要时可以酌情给予抗抑郁药。（9）甲亢的处理：暂停干扰素治疗，适当给予甲亢药物治疗，疾病稳定后可谨慎继续治疗。如何应对干扰素的不良反应如何应

14、对干扰素的不良反应体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市存在问题：产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞，来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，潜在的血源性病毒污染的可能性四、干扰素的制备路线四、干扰素的制备路线四、干扰素的制备路线四、干扰素的制备路线干扰素生产工艺路线（1）人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：1999年：IFN-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（2 2）基因工

15、程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（3 3）动物无限细胞系培养生产工艺：动物无限细胞系培养生产工艺：上市产品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166 aa 糖基化蛋白，

16、22.5 ku工艺特点：细胞培养，分泌表达缺点：产量低，成本高,过程严格干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（4 4）宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）上市产品：IFN-2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性工艺特点：发酵周期短（几个小时），无需变性、复性过程，获得有活性产品，纯化过程：淘汰抗体亲和层析干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（5 5）基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细胞里本身就存在

17、干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的，通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产，也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作，他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药物，具有非常诱人的前影。病毒的克星干扰素！干扰素是一种很时髦的新药。据报道，干扰素越来越神奇了，开始还只是治愈一些流感、肝炎、水痘之类的小毛病，现在对付许多肿瘤、癌症还有白血病都用上了干扰素。不但如此，由于它的越来越现代的生产方式，基因工程干扰素也已上市多年了。