基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版(2019)选择性必修3.pptx
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1、培育转基因抗虫棉的简要过程与载体与载体(质粒)(质粒)拼接拼接 普通棉花(无抗虫特性)(无抗虫特性)棉花细胞抗虫棉(有抗虫特性)(有抗虫特性)导入导入获得抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定自学指导1:阅读P76-P776-P77 7,限时3分钟1、培育转基因抗虫棉的步骤有哪些?2、目的基因的定义?实例有?3、目的基因的获取途径有哪些?最常用的是?4、筛选目的基因的方法有?最有效的是?5、简述Bt抗虫蛋白基因(Bt基因)的筛选过程思考:Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害?(1)概念:在基因工程的设计和操作中,用于
2、改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)实例:与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。1、目的基因资料:资料:苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(BtBt抗虫蛋白)抗虫蛋白),破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将科学家将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中,棉花产生转入棉花中,棉花产生Bt Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因主要指的是编码蛋白质的基因。那么如何筛选目的基因?筛选方法:筛选方法:从相关的从相关的已知结构和功能清晰已知结构和功能清晰的基因中进
3、行筛选的基因中进行筛选已知结构:已知结构:功能清晰:功能清晰:2、目的基因的筛选科学家掌握了科学家掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息 Bt Bt抗虫蛋白抗虫蛋白只在只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性现出毒性,对人和牲畜无影响对人和牲畜无影响利用测序技术、序列数据库(如利用测序技术、序列数据库(如GenBankGenBank)、序列对比工具(如)、序列对比工具(如BLASTBLAST)等,找)等,找到合适的目的基因到合适的目的基因Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,实例:Bt抗虫蛋白基因(Bt基因)的筛选过程苏云金杆菌(Bt)制成的
4、生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解:苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白),破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt抗虫蛋白的抗虫原理:当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后,多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合,导致细胞膜穿孔,最后造成害虫死亡。思考:Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害?那么如何获取目的基因?(1)人工合成:3、目的基因的获取 在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中
5、,科学家采用的是过程中,科学家采用的是人工合成人工合成的方法。的方法。前提:DNADNA合成仪合成仪转基因抗虫棉转基因抗虫棉基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成(2)利用PCR获取和扩增目的基因(常用)(3)从基因文库中获取基因文库:将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段,导入到受体菌的群体中储存,片段,导入到受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第一步第一步第一步第二步第二步第二步第二步第三步第三步第三步第三步第
6、四步第四步第四步第四步目的基因的检测与鉴定1、目的基因的筛选方法:从相关的从相关的已知结构和功能清晰已知结构和功能清晰的基因中进行筛选的基因中进行筛选2、目的基因的获取方法:(1)人工合成(2)利用PCR获取和扩增目的基因(3)从基因文库中获取利用测序技术、序列数据库(如利用测序技术、序列数据库(如GenBankGenBank)、序列对比工具(如)、序列对比工具(如BLASTBLAST)等,找)等,找到合适的目的基因到合适的目的基因1、聚合酶链式反应缩写为?定义是?原理是?该技术是由谁发明的?2、结合表3-1体内DNA复制过程,思考PCR的进行需要哪些条件?3、结合表3-5,PCR扩增的过程分
7、为几步?扩增结果结果是?扩增模板是?扩增方式?自学指导2:阅读P7 77 7-P7-P78 8,限时4分钟扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量思考:PCRPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应苏云金杆菌苏云金杆菌Bt基因基因?快速获得大量快速获得大量Bt基因基因提取提取(2)利用PCR获取和扩增目的基因3、目的基因的获取PCRPCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19851985年发明,为此,年发明,为此,穆里斯于穆里斯于19931993年获年获得诺贝尔化学奖。得诺贝尔化学奖。原理原理:定义定义:DNADNA半保留复制
8、半保留复制在在体体外外提提供供参参与与DNADNA复复制制的的各各种种组组分分与与反反应应条条件件,对对目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列进行大量复制的技术。列进行大量复制的技术。思考思考1 1:结合体内结合体内DNADNA复制过程,思考复制过程,思考PCRPCR的进行需要哪些条件?的进行需要哪些条件?体内体内DNADNA复制复制参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用PCRPCR中参与的组分中参与的组分4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸引物引物(通常为小的(通常为小的单链单链RNARNA)用高温代替用高温代替DNADNA(目的基因)模板(目的基因)模板4 4种脱氧核苷酸种
9、脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶)酶)与模板与模板DNADNA相结合的相结合的2 2种种引物引物(通常为小的(通常为小的单链单链D DNANA)反应还需要其它条件,如缓冲液(一般添加Mg2+2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶)、和控温设备DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA母链母链解旋酶解旋酶打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸知识归类PCR技术与细胞内
10、DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度,需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成原则:碱基互补配对目的基因的筛选与获取脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP腺苷(A)腺嘌呤脱氧核糖PPPOHH 在PCR过程中实际加入的为dNTP(即d
11、ATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料原料,又可为DNA的合成提供能量提供能量,因此因此不需要不需要额额外添加外添加。拓展引物相关知识1、概念:是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核(2030个核苷酸)。2、作用:引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。3、结合部位:引物结合在模板链的_。3端拓展35DNA母链135DNA母链235引物135引物235DNA母链135DNA母链2子链延伸方向5 34、PCR扩增时至少需要_种引物,原因是_2DNA的两条链是反向平行的,用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增5、PCR扩增的前提
12、是:根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物6、设计引物时必须依据:目的基因的核苷酸序列7、设计引物的要求:同种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是:_2种引物之间不能发生碱基互补配对,原因是:_。防止引物自身折叠防止引物之间配对,导致引物不能与模板链结合引物相关知识拓展两种引物的要求?(理解)引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短,防止引物随机结合耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)4种脱氧核苷酸(DNTP)引物待扩增的DNA片段(模板)55变性复性延伸温度上升到90以上,双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72
13、左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3端合成新的DNA链。72是Taq酶的最适温度PCR扩增过程第二轮循环的产物第三轮的产物35353535第一轮循环的产物3535【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要一次性加入。扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量22046814262n2n+1-22n-21372n-1PCR扩增DNA规律 由于一个一个循环得到的产物产物又可以作为下一个下一个循环的模板模板,因而每一每一次循环后次循环后目的基因的量可以增加一倍增加一倍。即成即成指数形式扩
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