生物芯片技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

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1、生物芯片技术生物芯片技术(BIOCHIP TECHNOLOGY)BIOCHIP TECHNOLOGY)第1页研究历史研究历史(Research history)1991 Affymatrix企业Stephen Fodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA Chip概念 Stanford大学Brown试验室：预先合成，机械手阵列1995 Schena等：基因表示谱1996 Chee et al：DNA测序1996 Cronin et al：突变检测1996 Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆1996 Shalon et al：复杂DNA样本分析1996 Shoema

2、ker et al：缺省突变定量表型分析第2页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片（biochip）概念指采取光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物表面，组成密集二维分子排列，然后与已标识待测生物样品中靶分子杂交，经过特定仪器对杂交信号强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子数量。第3页依据生物分子之间特异性相互作用原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小载体表面，经过分子之间特征性反应，检测另外一方有没有、多少或者结

3、构改变等第4页生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织微点阵(microarray）。未来十年最具发展潜力技术。第5页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片主要特点：高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化惯用生物芯片分类：基因芯片、蛋白质芯片及芯片试验室第6页特点特点高度并行性：提升试验进程、利于显示图谱快速对照和阅读。多样性：可进行样品多方面分析，提升准确性，降低误差。微型化：降低试剂用量和反应液体积，提升样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，确保质量。第7页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术1.基因芯片（Gene

4、chip）又称DNA芯片,是依据核酸杂交原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标识样品进行杂交，经过检测杂交信号强度及分布来进行分析。第8页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术2.蛋白质芯片(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。第9页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术3.芯片试验室(labs-on-chip)高度集成化集样品制备、基因扩增、核酸标识及检测为一体便携式生物分析系统。实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。芯片试验室是生物芯片

5、技术发展最终目标。第10页其它分类方法（依据应用）其它分类方法（依据应用）基因变异检测芯片疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)法医判定(如DNA指纹图谱)表示谱芯片肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表示差异)药品筛选(培养细胞药品刺激前后表示差异)发育(同一组织不一样发育时期基因表示差异)组织发生(不一样组织或器官基因表示差异)第11页依据工艺和载体1.原位合成法：密集程度高，可合成任意序列寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。第12页 2.DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片载体需表面紧质、光滑

6、固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片惯用玻片为载体。第13页依据依据DNADNA成份成份寡聚核苷酸或DNA片段：约2025个核苷酸碱基，惯用于基因类型分析，如突变、正常变异（多态性）。全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通惯用于两种或以上样本相关基因表示分析。第14页基因芯片种类基因芯片种类Science Chip：生物分析和诊疗Nutri Chip：食物分析、转基因、污染检测Leuko Chip：血液分析、病毒分析、HLA分析Aqua Chip：水质分析Secure Chip：含DNA物质判定Chromo Chip：基因分析和染色体序列Prokaryo Chip：原核生物、

7、兽医、环境保护等第15页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第16页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第17页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片DNA芯片技术包含四个主要步骤芯片设计与制备样品制备杂交反应和信号检测结果分析第18页生物芯片技术主要步骤生物芯片技术主要步骤芯片制备：微点阵芯片制备：微点阵样本制备：样本制备：DNADNA提纯、扩增、标识提纯、扩增、标识杂交：样本与互补模板形成双链杂交：样本与互补模板形成双链检测：共聚焦扫描，双色激光检测：共聚焦扫描，双色激光数据处理：定量软件，数据库检索，数据处理：定量软件

8、，数据库检索，RNARNA印迹等。印迹等。结果结果 第19页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第20页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片 二、样品制备二、样品制备 三、杂交与结果分析三、杂交与结果分析 四、基因芯片技术在医学中应用四、基因芯片技术在医学中应用一、芯片制备一、芯片制备第21页一、芯片制备一、芯片制备基因芯片制备主要包含两个方面探针设计：依据应用目标不一样，设计不一样固定于芯片上探针。探针在芯片上布局：选择适当方式将探针排布在芯片上。第22页一、芯片制备一、芯片制备（二）（二）DNADNA芯片制备芯片制备（一）探针设计（一）探针设计第23页（一）探针设计（一）探针设计1.表示型

9、芯片探针设计 不需要知道待测样品中靶基因准确细节 序列特异性应放在首要位置 2.单核苷酸多态性检测芯片探针设计 等长移位设计法 3.特定突变位点探针设计 叠瓦式策略 一、芯片制备一、芯片制备第24页第25页一、芯片制备一、芯片制备 图102第26页（二）DNA芯片制备1载体选择与预处理 载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应固相材料。载体材料：玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚丙烯膜等。载体化学处理：活化剂多聚赖氨酸 氨基硅烷偶联剂一、芯片制备一、芯片制备第27页2基因芯片制备（1）原位合成（in situ synthesis）光导原位合成法 原位喷印合成 分子印章

10、屡次压印合成（2）点样法 第28页芯片制备芯片制备原位合成法（in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适合用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是当前制造高密度寡核苷酸最为成功方法。第29页一、芯片制备一、芯片制备 图103第30页合成后交联（post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过玻片或其它材料上。主要用于诊疗、检测病原体及其它特殊要求中、低密度芯片制备。第31页两种制备方法比较原位合成：测序、查明点突变 高密度、依据已知DNA编制程序 制作复杂、价格昂贵、不能

11、测定未知DNA序列合成后交联：比较分析 制备方式直接和简单，点样样品可事先纯化，交联方式多样，可设计和制备符合自己需要芯 片。中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存 大量样品。第32页二、样品制备二、样品制备样品制备过程包含 核酸分子纯化、扩增和标识 第33页样本制备样本制备制备高质量样本是困难但又是极其主要。制备细胞、组织或整个器官样本应尤其小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成份等轻微改变都会使基因表示结果发生显著改变。用于基因类型分析样本是DNA，用于表示研究样本是cDNA。样本制备后应进行标识，通常为酶标识、荧光标识和核素标识。第34页三、杂交与结果分析三、杂交与结果分析（一）杂

12、交反应：与传统杂交方法类似（二）杂交信号检测：最惯用荧光法（三）数据分析：芯片杂交图谱处理与存放由专 门设计软件来完成。第35页杂交杂交是芯片技术中除方阵构建外最主要一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。选择杂交条件时，必须满足检测时灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能确保每条探针都能与互补模板杂交。适当长度DNA有利于与探针杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。第36页结果分析结果分析 芯片与标识靶芯片与标识靶DNADNA或或RNARNA杂交后，或与标识靶抗杂交后，或与标识靶抗原或抗体结合后，可采取以下方法分析处理数原或抗体结合后

13、，可采取以下方法分析处理数据：据：共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。较低。质谱法：快速、准确，可准确判断是否存在基质谱法：快速、准确，可准确判断是否存在基因突变和准确判断突变基因序列位置。探针合因突变和准确判断突变基因序列位置。探针合成较复杂。成较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷改变检测等。电荷改变检测等。第37页芯片扫读装置芯片扫读装置依据采取光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。依据激光光源，可分为激光型和非激光。应用最为广泛是激光光源共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好

14、定位功效，可定量，应用广泛。第38页图象分析复杂杂交图谱普通需由图象分析软件来完成。分析软件功效：判定每个点阵、最大程度消除本底荧光干扰、解析各种颜色图象、可标识或排除假阳性、识别和分析对照试验是否成功、可将信号标准化等。图象处理软件必须具备提取基因库和数据库能力。第39页四、基因芯片技术在医学中应用四、基因芯片技术在医学中应用1.基因表示分析 2.基因型、基因突变和多态性分析 3.疾病诊疗：遗传性、感染性、肿瘤 4.药品筛选 5.指导用药及治疗方案 6.预防医学 第40页四、基因芯片技术在医学中应用四、基因芯片技术在医学中应用第41页生物芯片分析标准生物芯片分析标准1 1、测定过程应包含五个

15、基本步骤：、测定过程应包含五个基本步骤：需处理生物学问题需处理生物学问题样本制备样本制备生物化学反应生物化学反应检测检测数据分析数据分析第42页2、生物学系统控制必须准确地与检测目标相匹配。3、生物学样本必须准确地与生物学种类相匹配。4、全部基因分析必须平行处理。5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6、平行格式必须准确依据生物学样本次序。7、检测系统必须能准确地取得数据。8、检测系统取得数据必须能被准确地控制和重复。第43页9 9、两种或以上平行数据组比较应受到单、两种或以上平行数据组比较应受到单 个试验所固有特征限制。个试验所固有特征限制。1010、绝对百分比关系只存在于组合试验平、绝对

16、百分比关系只存在于组合试验平 行数据组内。行数据组内。1111、平行格式包含内在和外部整个系统、平行格式包含内在和外部整个系统 误差分析原因。误差分析原因。1212、在每个系统模块中采集到该系统全部、在每个系统模块中采集到该系统全部 变量四维数据时，才能称为完成生变量四维数据时，才能称为完成生 物系统平行基因分析。物系统平行基因分析。第44页生物芯片技术生物芯片技术1212条标准只是一个基本框条标准只是一个基本框架。其术语详细定义和相关理论可参见架。其术语详细定义和相关理论可参见http:/cmgm.stanford.edu/schena/http:/cmgm.stanford.edu/sch

17、ena/http:/ Blot(证实某一基因相对表示水平)、Western Blot(RNA表示是否到达细胞中蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。第48页第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第49页第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片（protein chip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体表面形成微阵列；用标识了荧光蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合成份，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间相互作用关系。第50页第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片依据制作方法和应用不一样，蛋白质芯片

18、分为两种1.蛋白质功效芯片 细胞中每一个蛋白质占据芯片上一个确定 点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性。2.蛋白质检测芯片 将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中 靶多肽高度特异性配体进行点阵。这种芯片 能够高度并行检测生物样品中蛋白质。第51页第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第52页第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片技术在医学中应用1.特异性抗原抗体检测 2.生化反应检测 3.疾病诊疗 4.对疾病分子机制研究 5.药品筛选及新药研制开发 第53页抗体和蛋白质阵列技术蛋白质组学(protiomics)兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术发展。Pareick Brown使用特异性抗体

19、微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不一样蛋白质。Leuking等采取蛋白质微阵列技术，测定了10pg微量蛋白质，并证实假阳性极低。第54页乳腺癌基因芯片第55页Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999)每种基因数据以行表示，每个试验用列表示。颜色强度表示对照和试验cDNA比率。比率相同时为1。结果为红色表示mRNA增加，绿色表示降低，灰白色表示缺乏。两种基因相同性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。第56页DNA微矩阵分析软组织肉瘤表示Kavine Maillard et al(1999)cDNAs进行DNA表示矩阵，PCR产物包被在经赖氨酸处理

20、玻片上，用Cys3-和Cys5-标识cDNA进行杂交，洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵，表示数据储存在ACeDB数据库中，依据数据表示类型区分不一样基因。第57页微矩阵分析微矩阵分析DNADNA和蛋白表示和蛋白表示Holger Eickhoff et al.(1999)Holger Eickhoff et al.(1999)依据已经有序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表示分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标识人组织RNAs与被选38000人基因片段矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织图象，用软件分析

21、点识别和点定量。使用寡聚核苷酸判定新cDNA克隆，和进入表示载体，使对应蛋白能直接表示，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA关系。第58页生物芯片相关仪器点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。杂交仪：全自动完成调整、加探针、漂洗和热循环杂交过程。扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。第59页微矩阵仪器介绍Q BotQ PixQ ArrayQ PetQ Soft 第60页第61页Q Bot超高解析基因筛选暨排列分析仪。超高解析基因筛选暨排列分析仪。基因菌落筛选基因菌落筛选(Colony Picking)(Colony Picking)：3500/h

22、3500/h基因排列打点基因排列打点(Gridding)(Gridding)：100000/h100000/h基因复制基因复制(Replication)(Replication)：969696,9696,96384384基因重新排列基因重新排列(Re-Arraying)(Re-Arraying)：正确基因置复制盘：正确基因置复制盘基因微矩阵排列基因微矩阵排列(Micro-Arraying)(Micro-Arraying)：0/0/片片全自动液体分注系统全自动液体分注系统(Liquid Handling):96(Liquid Handling):96针，注液量针，注液量1 1 200200 l

23、l，适合，适合PCRPCR产物。产物。分析软件：分析、质控、上网。分析软件：分析、质控、上网。环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板第62页第63页Q Pix半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型)基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h基因排列打点(Gridding)：100000/h基因复制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正确基因置复制盘基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：0/片分析软件：分析、质控、上网环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板第64页第

24、65页Q Array第三代半敞开式基因微矩阵排列仪。基因微矩阵排列(Microarrying)：同时处理84片玻片，每一打点玻片分4个区域，可安排不一样矩阵排列。可选16或24针座。仪器容量：玻片84片，玻片架6个，384孔板5盘。分析软件：分析、质控、上网。环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板。第66页自动液体处理系统。第67页杂交仪Affymetrix 640杂交仪：温度范围：0100C探针用量：l流速：10ml/min样本区：2.46.4cm第68页扫描仪GenearrayGenearrayTMTM扫描仪：扫描仪：激光：氩离子激光：氩离子,488nm,488nm适用染料：荧光素、

25、藻适用染料：荧光素、藻红素红素单扫描时间：单扫描时间：44分钟分钟分辨率：分辨率：3 3、6 6、9 9或或2424微米微米第69页生物芯片技术发展发展趋势微型化：DNA矩阵越来越小。集成化：矩阵上基因组越来越大。多样化：测定范围越来越广。微量化：测定所需样本越来越少。全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。定量化：如激光捕捉技术，显微解剖技术等可准确测定一个细胞内一个基因表示。DNA矩阵数据信息库完善。第70页生物芯片技术发展生物芯片技术发展技术技术毛细管电泳芯片技术毛细管电泳芯片技术PCRPCR芯片技术芯片技术(PCR-Chip)(PCR-Chip)缩微芯片试验室缩微芯片试验室(lab-

26、on-a-chip)(lab-on-a-chip)微珠芯片技术微珠芯片技术(beadArray)(beadArray)抗体和蛋白质阵列技术抗体和蛋白质阵列技术(Antibody and(Antibody and protein-array technology)protein-array technology)自我定制芯片技术（自我定制芯片技术（make your own chip)make your own chip)血气分析芯片血气分析芯片第71页毛细管电泳芯片技术Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列测定。宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利

27、用毛细管电泳芯片分离了用于诊疗杜鑫-贝克肌萎缩多条DNA片段。瑞士Ciba-Geigy企业和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸分离。第72页缩微芯片试验室在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示全部过程，结果地从混有大肠杆菌血清中分离出了细菌。含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合芯片。LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性“未来型掌上试验室”构想。第73页第74页第75页controlEx5-siRNA第76页第77页第78页第79页思索题1.名词解释 生物芯片 DNA芯片 蛋白质芯片2.表示芯片探针怎样设计？3.基因芯片应用价值4.芯片技术基本流程第80页