生物化学与分子生物学八市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

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1、目目 录录第第 十十 章章三羧酸循环三羧酸循环Tricarboxylic Acid Cycle第1页目目 录录第第 一一 节节 三羧酸循环发觉三羧酸循环发觉Discovery of the Citric Acid Cycle第2页目目 录录糖原糖原 三酯酰甘油三酯酰甘油 蛋白质蛋白质 葡萄糖葡萄糖 脂酸脂酸+甘油甘油 氨基酸氨基酸 乙酰乙酰CoA TCA循环循环 2H 2H 呼呼吸吸链链 H H2 2O O ADP+Pi ATP COCO2 2 *营养物在生物体内氧化普通过程营养物在生物体内氧化普通过程营养物在生物体内氧化普通过程营养物在生物体内氧化普通过程一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分一

2、、三羧酸循环是三类营养物质氧化分解（共同）第二阶段解（共同）第二阶段第3页目目 录录n在真核生物，在真核生物，TCA循环在循环在线粒体线粒体中进行，中进行，与呼吸链在功效和结构上相偶联。与呼吸链在功效和结构上相偶联。第4页目目 录录三三羧羧酸酸循循环环亦亦称称柠柠檬檬酸酸循循环环（citric acid cycle），这这是是因因为为循循环环反反应应中中第第一一个个中中间间产产物物是是一一个个含含三三个个羧羧基基柠柠檬檬酸酸。因因为为Krebs正正式式提提出出了了三三羧羧酸酸循循环环学学说说，故故此此循循环环又又称称为为Krebs循环。循环。二、二、Krebs发觉三羧酸循环发觉三羧酸循环第5页

3、目目 录录n1937年年，Hans Krebs利利用用鸽鸽子子胸胸肌肌（这这块块肌肌肉肉在在飞飞行行中中有有相相当当高高呼呼吸吸频频率率，所所以以尤尤其其适适合合于于氧氧化化过过程程研研究究）组组织织悬悬液液，测测定定了了在在不不一一样样有有机机酸酸作作用用下下，丙丙酮酮酸酸氧氧化化过过程程中中耗耗氧氧率率，首首次次提提出出在在动动物组织中丙酮酸氧化路径假说物组织中丙酮酸氧化路径假说。第6页目目 录录nAlbert Szent-Gyorgyi等等已已经经发发觉觉动动物物肌肌肉肉组组织织中中一一些些4碳碳二二羧羧酸酸（琥琥珀珀酸酸、延延胡胡索索酸酸、苹苹果果酸酸和和草草酰乙酸酰乙酸）能刺激氧消耗

4、。）能刺激氧消耗。nKrebs证证实实了了这这项项发发觉觉，而而且且发发觉觉它它们们也也可可刺刺激激丙丙酮酮酸酸氧氧化化过过程程。而而且且他他还还发发觉觉肌肌肉肉中中丙丙酮酮酸酸氧氧化化还还可可被被6碳碳三三羧羧酸酸，如如柠柠檬檬酸酸、顺顺乌乌头头酸酸和和异异柠柠檬檬酸酸及及5碳碳-酮酮戊戊二二酸酸激激活活。上上述述有有机机酸酸激激活活效效应应是是显显著著，任任何何一一个个这这些些有有机机酸酸增增加加，甚甚至至是是极极少少许许增加都能大大激活丙酮酸氧化过程。增加都能大大激活丙酮酸氧化过程。第7页目目 录录nKrebs第第二二项项重重大大发发觉觉是是观观察察到到丙丙二二酸酸对对丙丙酮酮酸酸有有氧

5、氧化抑制作用。氧氧化抑制作用。n丙丙二二酸酸是是琥琥珀珀酸酸类类似似物物，是是琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶竞竞争争性性抑抑制制剂剂，在在肌肌肉肉悬悬浮浮液液中中，不不论论加加入入上上述述哪哪一一个个有有机机酸酸，只只要要丙丙二二酸酸存存在在，丙丙酮酮酸酸有有氧氧氧氧化化过过程程就就会会被被抑抑制制。这这表表明明在在包包括括丙丙酮酮酸酸氧氧化化酶酶促促反反应应中中，琥琥珀珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键成份。酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键成份。nKrebs深深入入发发觉觉，当当用用丙丙二二酸酸去去抑抑制制肌肌肉肉组组织织悬悬液液中中丙丙酮酮酸酸有有氧氧氧氧化化时时，在在这这个个悬悬液液介介质质中中就就会

6、会有有柠柠檬檬酸酸、-酮酮戊戊二二酸酸和和琥琥珀珀酸酸积积累累，这这表表明明柠柠檬檬酸酸和和-酮戊二酸通常为琥珀酸前体。酮戊二酸通常为琥珀酸前体。第8页目目 录录n依依据据上上述述试试验验观观察察和和一一些些其其它它证证据据，Krebs得得出出一一个个结结论论：上上述述有有机机三三羧羧酸酸和和二二羧羧酸酸能能够够以以一一个个符符合合化化学学逻逻辑辑序序列列排排列列。因因为为用用丙丙酮酮酸酸和和草草酰酰乙乙酸酸与与肌肌组组织织共共同同孵孵育育，即即可可造造成成溶溶液液介介质质中中柠柠檬檬酸酸堆堆积积，所所以以Krebs推推理理这这一一系系列列反反应应是是以以循循环环方方式式而而不不是是以以线线性

7、性方方式式存存在在，即即它它开开始始和和结结尾尾是是连连在在一起。一起。第9页目目 录录n从从这这些些简简单单试试验验和和逻逻辑辑推推理理中中，Krebs假假定定他他所所称称柠柠檬檬酸酸循循环环是是肌肌肉肉中中碳碳水水化化合合物物氧氧化化主主要要路路径径。柠柠檬檬酸酸循循环环也也称称TCA循循环环，因因为为在在Krebs提提出出这这个个循循环环假假说说若若干干年年以以后后，还还不不确确定定柠柠檬檬酸酸或或者者一一些些其其它它三三羧羧酸酸，比比如如异异柠柠檬檬酸酸是是否否是是由由丙丙酮酮酸酸和和草草酰酰乙乙酸酸反反应应所所形形成成第第一一个个产产物物。自自Krebs提提出出TCA循循环环假假设设

8、后后，研研究究发发觉觉该该循循环环不不但但在在肌肌肉肉组组织织中中起起作作用用，而而且且在在需需氧氧动动物物和和植植物物全全部部组组织织中中，以及许多需氧微生物中均发挥着功效。以及许多需氧微生物中均发挥着功效。第10页目目 录录nTCA循循环环最最初初只只是是建建立立在在试试验验基基础础上上假假说说。随随即即，在在体体外外对对参参加加循循环环中中酶酶研研究究证证实实并并说说明明了了该该循循环环细细节节。不不过过这这些些酶酶是是否否在在完完整整活活细细胞胞循循环环中中真真正正发发挥挥功功效效？细细胞胞内内该该循循环环效效率率是是否否足足以以解解释释动动物物组组织织中中葡葡萄萄糖糖氧氧化化效效率率

9、？这这些些问问题题已已经经经经过过用用同同位位素素标标识识代代谢谢物物研研究究（如如丙丙酮酮酸酸或或乙乙酸酸酯酯分分子子中中特特定定碳碳原原子子13C或或14C标标识识等等同同位位素素示示踪踪试试验验），证证实实TCA循循环环确确实实以以很很高高效效率率在在活活细细胞胞中中存存在在。现现在在TCA循循环环已已被被公公认认为为是是营营养养物物分分解解代代谢谢必必经经路径。路径。第11页目目 录录第第 二二 节节三羧酸循环反应过程三羧酸循环反应过程Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle Reactions第12页目目 录录nTCA循循环环是是一一个个由由一一系系

10、列列酶酶促促反反应应组组成成循循环环反反应应系系统统，在在该该反反应应过过程程中中，首首先先由由乙乙酰酰CoA（主主要要来来自自于于三三大大营营养养物物质质分分解解代代谢谢）与与草草酰酰乙乙酸酸缩缩合合生生成成含含3个个羧羧基基柠柠檬檬酸酸（citric acid），再再经经过过4次次脱脱氢氢、2次次脱脱羧羧，生生成成4分分子子还还原原当当量量（reducing equivalent）和和2分分子子CO2，重重新新生生成成草草酰酰乙乙酸酸这这一循环反应过程称为一循环反应过程称为三羧酸循环三羧酸循环。第13页目目 录录n还原当量（还原当量（reducing equivalent）普普普普通通通通

11、是是是是指指指指以以以以氢氢氢氢原原原原子子子子或或或或氢氢氢氢离离离离子子子子形形形形式式式式存存存存在在在在一一一一个电子或一个电子当量。个电子或一个电子当量。个电子或一个电子当量。个电子或一个电子当量。第14页目目 录录一、一、TCA循环由八步反应组成循环反应路径循环由八步反应组成循环反应路径第15页目目 录录（一）乙酰（一）乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸与草酰乙酸缩合成柠檬酸n 乙酰辅酶乙酰辅酶A（acetyl CoA）与草酰乙酸）与草酰乙酸（oxaloacetate）缩合成柠檬酸）缩合成柠檬酸（citrate）；）；n 反应由反应由柠檬酸合酶（柠檬酸合酶（citrate synth

12、ase）催化。催化。第16页目目 录录（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸n此反应是由此反应是由顺乌头酸酶顺乌头酸酶催化异构化反应。催化异构化反应。n由两步反应组成，由两步反应组成，(1)脱水反应；脱水反应；(2)水合反应。水合反应。第17页目目 录录（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为-酮戊二酸酮戊二酸n异柠檬酸在异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase）作用下，氧化脱羧而转）作用下，氧化脱羧而转变成变成 -酮戊二酸（酮戊二酸（-Ketoglutarate）。）。第18页目目 录录（四）（

13、四）-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰 CoAn在在-酮戊二酸脱氢酶复合体酮戊二酸脱氢酶复合体催化下催化下-酮戊二酸氧酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰化脱羧生成琥珀酰CoA(succinyl-CoA)；n该脱氢酶复合体组成及催化机制与丙酮酸脱氢酶该脱氢酶复合体组成及催化机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似。复合体类似。第19页目目 录录（五）琥珀酰（五）琥珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化合成酶催化底物水平磷酸化反应反应 n在在琥琥珀珀酰酰CoA合合成成酶酶催催化化下下，琥琥珀珀酰酰CoA高高能能硫硫酯酯键键水水解解与与GDP磷酸化偶联，生成琥珀酸、磷酸化偶联，生成琥珀酸、GTP和辅酶和

14、辅酶A。n这是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸键反应。这是三羧酸循环中唯一直接生成高能磷酸键反应。第20页GTPGDPATPADP核苷二磷核苷二磷酸激酶酸激酶目目 录录第21页目目 录录（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸 n此步反应由此步反应由琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶催化，其辅酶是催化，其辅酶是FAD，是三羧酸循环中唯一与内膜结合酶。是三羧酸循环中唯一与内膜结合酶。第22页目目 录录（七）延胡索酸加水生成苹果酸（七）延胡索酸加水生成苹果酸n延胡索酸酶延胡索酸酶催化此步反应催化此步反应第23页（八）（八）苹果酸脱氢生成草酰乙酸苹果酸脱氢生成草酰乙酸n苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶

15、催化此步反应，辅酶是催化此步反应，辅酶是NAD+。目目 录录第24页CoASHNADH+H+NAD+COCO2 2NAD+NADH+H+COCO2 2GTPGTPGDP+PiGDP+PiFADFADH2NADH+H+NAD+H2OH2OH2OCoASHCoASHH2O柠檬酸合酶柠檬酸合酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶-酮酮戊二酸脱戊二酸脱氢氢酶酶复合体复合体琥珀酰琥珀酰CoA合成酶合成酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶延胡索酸酶延胡索酸酶苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶GTPGDPATPADP核苷二磷酸激酶核苷二磷酸激酶目目 录录 第25页目目 录录2CO242H第26页目目 录录二、一次二

16、、一次TCA循环生成循环生成2分子分子CO2n在在TCA循循环环反反应应过过程程中中，从从2个个碳碳原原子子乙乙酰酰CoA与与4个个碳碳原原子子草草酰酰乙乙酸酸缩缩合合成成6个个碳碳原原子子柠柠檬檬酸酸开开始，始，重复地脱氢氧化。重复地脱氢氧化。nTCA循循环环中中经经过过脱脱羧羧方方式式生生成成CO2。1个个二二碳碳单单位位进进入入TCA后后，有有2次次脱脱羧羧反反应应，生生成成2分分子子CO2，这是体内，这是体内CO2主要起源。主要起源。nTCA循循环环过过程程中中，共共有有4次次脱脱氢氢，其其中中3次次脱脱氢氢由由NAD+接收，接收，1次由次由FAD接收。接收。第27页目目 录录nTCA

17、循环过程中，共有循环过程中，共有4次脱氢，其中次脱氢，其中3次脱氢由次脱氢由NAD+接收，接收，1次由次由FAD接收。接收。nTCA循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化生成生成1个个ATP。TCA循环总反应式：循环总反应式：CH3COSCoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+3H+FADH2+HSCoA+GTP第28页目目 录录三、三、TCA循环中间产物本身并无量改变循环中间产物本身并无量改变nTCA循环中间产物包含草酰乙酸在内起着催化剂循环中间产物包含草酰乙酸在内起着催化剂作用，本身并无量改变。作用，本身并无量改变。n不可

18、能经过不可能经过TCA直接从乙酰直接从乙酰CoA合成草酰乙酸或合成草酰乙酸或其它中间产物；一样，这些中间产物也不可能直其它中间产物；一样，这些中间产物也不可能直接在接在TCA循环中被氧化生成循环中被氧化生成CO2和和H2O。nTCA循环中草酰乙酸主要来自丙酮酸直接羧化，循环中草酰乙酸主要来自丙酮酸直接羧化，也可经过苹果酸脱氢产生。不论何种起源，其最也可经过苹果酸脱氢产生。不论何种起源，其最终起源是葡萄糖。终起源是葡萄糖。第29页目目 录录第第 三三 节节三羧酸循环调控三羧酸循环调控Regulation of Tricarboxylic Acid Cycle第30页目目 录录一、丙酮酸脱氢酶复合

19、体活性改变可一、丙酮酸脱氢酶复合体活性改变可影响乙酰影响乙酰CoA生成生成 n别构调整别构调整n n当当当当 脂脂脂脂 肪肪肪肪 酸酸酸酸 或或或或 乙乙乙乙 酰酰酰酰 CoACoA充充充充 分分分分 时时时时，或或或或 ATP/ADP ATP/ADP 和和和和 NADH/NAD_NADH/NAD_比值增高时，该酶活性被别构抑制；比值增高时，该酶活性被别构抑制；比值增高时，该酶活性被别构抑制；比值增高时，该酶活性被别构抑制；n n而而而而当当当当机机机机体体体体需需需需要要要要能能能能量量量量时时时时，或或或或ATP/ADPATP/ADP降降降降低低低低时时时时，该该该该酶酶酶酶被被被被AMP

20、AMP等变构激活。等变构激活。等变构激活。等变构激活。n化学修饰调整化学修饰调整当当当当胞胞胞胞内内内内ATPATP增增增增高高高高时时时时，丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸脱脱脱脱氢氢氢氢酶酶酶酶复复复复合合合合体体体体成成成成份份份份中中中中丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸脱氢酶（脱氢酶（脱氢酶（脱氢酶（E1E1）因为磷酸化而失活；）因为磷酸化而失活；）因为磷酸化而失活；）因为磷酸化而失活；当当当当ATPATP降降降降低低低低时时时时，磷磷磷磷蛋蛋蛋蛋白白白白磷磷磷磷酸酸酸酸酶酶酶酶去去去去除除除除E1E1上上上上磷磷磷磷酸酸酸酸基基基基团团团团而而而而激激激激活该复合体。活该复合体。活该复合体。活该复合

21、体。第31页目目 录录二、二、TCA循环受底物、产物和调整酶循环受底物、产物和调整酶活性调整活性调整nTCA循环速度和流量主要受种原因调控：循环速度和流量主要受种原因调控：底物供给量底物供给量催化循环最初几步反应酶反馈别构抑制催化循环最初几步反应酶反馈别构抑制产物堆积抑制作用产物堆积抑制作用第32页目目 录录（一）（一）TCA循环中有个调整调整酶循环中有个调整调整酶nTCA循环中催化个不可逆反应酶：循环中催化个不可逆反应酶：柠檬酸合酶柠檬酸合酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶第33页目目 录录乙酰乙酰CoA 柠檬酸柠檬酸 草酰乙酸草酰乙酸 琥珀酰琥珀酰CoA -酮戊二

22、酸酮戊二酸 异柠檬酸异柠檬酸 苹果酸苹果酸 NADH FADH2 GTPATP异柠檬酸异柠檬酸 脱氢酶脱氢酶柠檬酸合酶柠檬酸合酶 -酮戊二酸酮戊二酸脱氢酶复合体脱氢酶复合体 ATP +ADP ADP +ATP 柠檬酸柠檬酸 琥珀酰琥珀酰CoA NADH 琥珀酰琥珀酰CoA NADH +Ca2+Ca2+ATP、ADP影响影响 产物堆积引发抑制产物堆积引发抑制循循环环中中后后续续反反应应中中间间产产物物别别位位反反馈馈抑抑制制前前面面反反应应中酶中酶其它，如其它，如Ca2+可可激活许多酶激活许多酶三羧酸循环调整三羧酸循环调整第34页目目 录录（二）（二）TCA循环与上游和下游反应协调循环与上游和下

23、游反应协调n在正常情况下，（糖）酵解路径和在正常情况下，（糖）酵解路径和TCA循环速循环速度相协调；度相协调；n氧化磷酸化速率对氧化磷酸化速率对TCA循环运转也起着非常主循环运转也起着非常主要作用。要作用。第35页目目 录录三、三、TCA循环各种酶以复合体形式存循环各种酶以复合体形式存在于线粒体在于线粒体nTCA循环中酶在线粒体中是以各种酶组成复合循环中酶在线粒体中是以各种酶组成复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室（metabolons），它在细胞内能够有效地将代），它在细胞内能够有效地将代谢中间产物从一个酶传递给另一个酶。这些复谢中间产物从一个酶传

24、递给另一个酶。这些复合体含有高效介导中间产物流通功效，所以也合体含有高效介导中间产物流通功效，所以也可影响代谢速率。可影响代谢速率。第36页目目 录录第四节第四节三羧酸循环生理意义三羧酸循环生理意义 Physiologic Significance of Tricarboxylic Acid Cycle第37页目目 录录一、一、TCA循环是一条循环是一条“两用代谢路径两用代谢路径”nTCA循环在大多数生物中是分解代谢路径循环在大多数生物中是分解代谢路径;n各种生物合成路径也利用各种生物合成路径也利用TCA循环中间产物作循环中间产物作为合成反应起始物。为合成反应起始物。（一）（一）TCA循环参加

25、合成和分解路径组成循环参加合成和分解路径组成第38页目目 录录TCA中间产物中间产物（二）（二）TCA循环中间产物是合成糖、脂肪酸和循环中间产物是合成糖、脂肪酸和氨基酸前体氨基酸前体1.TCA循环中间产物能够异生为糖循环中间产物能够异生为糖草酰乙酸草酰乙酸异生为葡萄糖异生为葡萄糖氨基酸氨基酸第39页目目 录录乙酰乙酰CoA2.TCA循环中间产物可为脂酸合成提供原料循环中间产物可为脂酸合成提供原料合成脂酸合成脂酸柠檬酸柠檬酸-丙酮酸循环丙酮酸循环第40页目目 录录-酮戊二酸酮戊二酸+NH4+3.TCA循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架谷氨酸谷氨酸谷氨

26、酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶NADH+H+NAD+第41页目目 录录第42页目目 录录（三）添补反应补充（三）添补反应补充TCA循环中间产物循环中间产物n参加其它代谢路径而消耗参加其它代谢路径而消耗TCA循环中间产物必须循环中间产物必须及时补充，才能保持及时补充，才能保持TCA循环顺利进行。这类反循环顺利进行。这类反应被称为应被称为添补反应（添补反应（anaplerotic reaction）。n最主要添补反应是由丙酮酸羧化酶催化，从丙酮最主要添补反应是由丙酮酸羧化酶催化，从丙酮酸生成草酰乙酸反应。酸生成草酰乙酸反应。丙酮酸丙酮酸+CO2草酰乙酸草酰乙酸丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶ATPADP+Pi第43

27、页目目 录录n乙酰乙酰CoA是丙酮酸羧化酶激活剂；是丙酮酸羧化酶激活剂；nTCA循环中酶促反应能够将草酰乙酸转变为其它循环中酶促反应能够将草酰乙酸转变为其它中间产物；中间产物；n另外，可由别路径生成一些中间产物，如：另外，可由别路径生成一些中间产物，如：奇数碳链脂肪酸奇数碳链脂肪酸琥珀酰琥珀酰CoA一些氨基酸一些氨基酸-酮戊二酸、草酰乙酸酮戊二酸、草酰乙酸第44页目目 录录二、二、TCA循环在三大营养物质代谢中循环在三大营养物质代谢中含有主要生理意义含有主要生理意义（一）（一）TCA循环是三大营养物质最终代谢通循环是三大营养物质最终代谢通路路（二）（二）TCA循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联循环是

28、糖、脂肪和氨基酸代谢联络枢纽络枢纽第45页目目 录录第五节第五节三羧酸循环关键反应分析原三羧酸循环关键反应分析原理理 Analytical Principles of Key Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle第46页目目 录录一、采取分光光度法测定硫氢辅酶一、采取分光光度法测定硫氢辅酶A生成量分析柠檬酸合酶活性生成量分析柠檬酸合酶活性反反应应生生成成辅辅酶酶A和和5,5-二二硫硫代代双双（2-硝硝基基苯苯甲甲酸酸）（DNTB）在在pH 7.4、0.1 M 三三乙乙醇醇胺胺和和 0.2 M 乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸钙钙钠钠（EDTA）溶溶液液中中反反应应

29、生生成成硫硫氢氢辅辅酶酶A，其其在在412 nm时时有有吸吸收收峰峰，经经过过分分光光光光度度计计测测定定吸吸光光度度，测测定定硫硫氢氢辅辅酶酶A生生成量。以此反应柠檬酸合酶酶活性。成量。以此反应柠檬酸合酶酶活性。第47页目目 录录二、采取分光光度法检测二、采取分光光度法检测NADH生成生成量分析异柠檬酸脱氢酶活性量分析异柠檬酸脱氢酶活性反反应应中中异异柠柠檬檬酸酸脱脱氢氢酶酶酶酶活活性性检检测测主主要要经经过过测测定定生生成成NADH在在340 nm吸吸光光度度。检检测测体体系系包包含含120 mM D，L-异异柠柠檬檬酸三钠酸三钠，30 mM 硫酸锰硫酸锰,20 mM NAD+及异柠檬酸脱

30、氢酶。及异柠檬酸脱氢酶。第48页目目 录录三、采取分光光度法测定三、采取分光光度法测定NADH生成生成量分析量分析-酮戊二酸脱氢酶活性酮戊二酸脱氢酶活性经经过过测测定定NADH在在340 nm时时吸吸光光度度改改变变反反应应-酮酮戊戊二二酸酸脱脱氢氢酶酶复复合合体体酶酶活活性性。检检测测体体系系包包含含1.0 ml磷磷酸酸盐盐；0.15 ml 辅酶辅酶A；0.1 ml 半胱氨酸半胱氨酸;0.1 ml NAD+；0.5ml酶。酶。第49页目目 录录四、采取分光光度法测定顺乌头酸生成四、采取分光光度法测定顺乌头酸生成量分析顺乌头酸酶活性量分析顺乌头酸酶活性检检测测体体系系包包含含100 mmol/L 氯氯化化钠钠，30 mmol/L柠柠檬檬酸酸钠钠,20 mmol/L Tris/HCl 和和酶酶，在在 1.00 ml反反应应终终体体积积，pH 7.4溶溶液液中中，反反应应在在25进进行行，经经过过检检测测顺顺乌乌头头酸酸在在240nm吸吸光光度度反应顺乌头酸酶酶活性。反应顺乌头酸酶酶活性。第50页