《SDSPAGE凝胶电泳》课件.pptx

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1、SDSPAGE凝胶电泳 制作人：制作者PPT时间：2024年X月目录第第1 1章章 SDSPAGE SDSPAGE凝胶电泳凝胶电泳第第2 2章章 实验材料与仪器实验材料与仪器第第3 3章章 样品处理样品处理第第4 4章章 凝胶制备凝胶制备第第5 5章章 蛋白质电泳蛋白质电泳第第6 6章章 总结总结第第7 7章章 附录附录 0101第1章 SDSPAGE凝胶电泳 什么是SDSPAGE凝胶电泳SDSPAGE凝胶电泳是一种用于测定蛋白质分子量的方法，能够将样品中的蛋白质分离成不同分子量的条带，便于后续的分析。SDSPAGE凝胶电泳的作用分离不同分子量的蛋白质条带测定蛋白质分子量通过条带的清晰度来判断

2、蛋白质的纯度判断蛋白质纯度与已知分子量蛋白质进行比对，鉴定未知蛋白质鉴定蛋白质通过条带的密度来测定蛋白质的含量测定蛋白质含量SDSSDS与蛋白质相与蛋白质相互作用的原理互作用的原理SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它能够与蛋白质中的氨基酸残基是一种阴离子表面活性剂，它能够与蛋白质中的氨基酸残基相互作用，使蛋白质带负电荷。在经过电泳的作用下，负电荷的相互作用，使蛋白质带负电荷。在经过电泳的作用下，负电荷的蛋白质会向正电极移动，在凝胶上留下不同分子量的条带。蛋白质会向正电极移动，在凝胶上留下不同分子量的条带。电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液一般由电泳缓冲液一般由Tris-HClTris-HCl、S

3、DSSDS和甘氨酸等成分组成。和甘氨酸等成分组成。它能够提供电导性和它能够提供电导性和pHpH稳定性，稳定性，使电泳过程更加稳定和可靠。使电泳过程更加稳定和可靠。电场电场电场是凝胶电泳的驱动力，可电场是凝胶电泳的驱动力，可以通过电极间的距离和电压来以通过电极间的距离和电压来调节。调节。一般情况下，电极间距离越短，一般情况下，电极间距离越短，电压越高，分离效果越好，但电压越高，分离效果越好，但也会导致凝胶加热和样品烧焦。也会导致凝胶加热和样品烧焦。染色和图像分析染色和图像分析凝胶染色一般采用凝胶染色一般采用Coomassie Coomassie BlueBlue或或Silver StainSil

4、ver Stain等方法。等方法。图像分析既可以通过目视观察，图像分析既可以通过目视观察，也可以使用专业的软件进行半也可以使用专业的软件进行半定量和定量分析。定量和定量分析。凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是一种由丙烯聚丙烯酰胺凝胶是一种由丙烯酰胺单体聚合而成的凝胶，具酰胺单体聚合而成的凝胶，具有良好的生物相容性和透明度。有良好的生物相容性和透明度。它的网孔大小可以通过控制单它的网孔大小可以通过控制单体浓度、交联剂浓度和电泳运体浓度、交联剂浓度和电泳运行条件等参数来调节。行条件等参数来调节。搭建电泳仪、准备电泳缓冲液、制备凝胶准备工作0103根据样品的不同选择适当的电泳

5、条件制备样品电泳02加入SDS和还原剂、煮沸处理、离心等步骤样品处理实验结果分析SDSPAGE凝胶电泳的实验结果一般可以通过凝胶染色和图像分析来获得。凝胶染色可以使不同分子量的蛋白质条带在凝胶上得到显色，而图像分析可以对这些条带进行定量和半定量的分析。另外，还可以通过蛋白质定量的方法来计算出每个条带所对应的蛋白质含量。0202第2章 实验材料与仪器 实验材料琼脂糖、甘油等基础材料超薄金属箔、贵金属纳米粒子等高级材料 蛋白质定量仪蛋白质定量仪NanoDropNanoDrop蛋白质定量仪蛋白质定量仪比色法定量仪比色法定量仪 实验仪器常见的实验仪器常见的实验仪器洗脱仪洗脱仪电泳仪电泳仪印迹仪印迹仪实

6、验环境洁净度、温度、湿度等实验室要求废液处理、实验仪器的维护等环保要求 安全注意事项化学品溅入眼睛、高压电等实验中的安全问题火灾、漏电等紧急情况的处理 NanoDropNanoDrop蛋蛋白质定量仪白质定量仪NanoDropNanoDrop蛋白质定量仪可以快速、准确地测量样品中的蛋白质蛋白质定量仪可以快速、准确地测量样品中的蛋白质含量。其使用纳米卷绕技术使得需要的样本量降低到微升级别，含量。其使用纳米卷绕技术使得需要的样本量降低到微升级别，并且可以消除干扰，以提高准确度。并且可以消除干扰，以提高准确度。厚度在几微米以下超薄金属箔0103 02直径在几纳米级别贵金属纳米粒子实验室要求-洁净度洁净

7、度要求高，实验室要保持整洁干净。实验人员需佩戴实验室服、口罩、手套等防护用品。0303第3章 样品处理 样品类型细胞培养基组织 样品预处理蛋白提取活化蛋白的提取 样品处理实验步骤细胞的收集组织的收集蛋白质的提取 样品处理实验结果分析蛋白质的纯度蛋白质的浓度样品稳定性 蛋白质提取过程蛋白质提取过程蛋白质提取是蛋白质提取是SDS-PAGESDS-PAGE凝胶电泳实验的关键步骤之一。其目凝胶电泳实验的关键步骤之一。其目的是从样品中提取出蛋白质。通常采用细胞裂解和离心沉淀的方的是从样品中提取出蛋白质。通常采用细胞裂解和离心沉淀的方法，将蛋白质从细胞或组织中释放出来。然后通过各种手段，如法，将蛋白质从细

8、胞或组织中释放出来。然后通过各种手段，如加入蛋白酶抑制剂、加入蛋白酶抑制剂、pHpH调节剂等，保护蛋白质的完整性。最后调节剂等，保护蛋白质的完整性。最后通过离心沉淀等方法，得到纯净的蛋白质溶液，用于后续的通过离心沉淀等方法，得到纯净的蛋白质溶液，用于后续的SDS-PAGESDS-PAGE凝胶电泳分析。凝胶电泳分析。细胞相关问题常用方法包括机械剪切、利用胰酶等细胞的收集方法细胞数量过少会影响蛋白质的提取效率细胞数量的影响细胞培养基种类的不同会影响蛋白质的表达量和纯度细胞培养基的影响细胞的活性和生长状态会影响蛋白质的表达量和纯度细胞状态的影响蛋白质提取、纯化及浓度测定样品处理0103样品加荷、电泳

9、运行电泳02聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等制备凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶分离范围广分离范围广分辨率不如聚丙烯酰胺凝胶分辨率不如聚丙烯酰胺凝胶操作相对繁琐操作相对繁琐不同孔径的凝胶可供选择不同孔径的凝胶可供选择Coomassie Coomassie Brilliant BlueBrilliant Blue染色染色灵敏度高灵敏度高可以定量分析可以定量分析染色时间长染色时间长染色后不能再进行其他分析染色后不能再进行其他分析SilverSilver染色染色灵敏度极高灵敏度极高能检测到微量的蛋白质能检测到微量的蛋白质染色时间长染色时间长染色后不能再进行其他分析染色后不能再进行其他分析SDS-PAGE凝胶电泳

10、常见问题比较聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶分离能力强分离能力强对小分子产生一定的限制对小分子产生一定的限制方便操作方便操作不同孔径的凝胶可供选择不同孔径的凝胶可供选择样品处理实验结果分析蛋白质稳定性半衰期是指蛋白质浓度降至原始浓度的一半所需要的时间。半衰期越长，蛋白质稳定性越好。失活率是指蛋白质失活的程度。失活率越低，蛋白质稳定性越好。蛋白质稳定性是影响实验结果准确性的重要因素之一，需要在蛋白质提取、存储和运输等过程中加以控制和评估。0404第4章 凝胶制备 凝胶的种类常用于核酸电泳和蛋白质电泳聚丙烯酰胺凝胶常用于蛋白质电泳聚丙烯酰胺凝胶板 凝胶制备原料及注意事项凝胶制备中各种成分的比例要掌握好

11、比例凝胶制备过程中要注意卫生和安全，保证实验顺利进行注意事项 凝胶制备步骤根据实验需求配制合适的缓冲液配制缓冲液将配制好的凝胶液浇注入凝胶板中浇注凝胶将凝胶板放置于冷却装置中，成型后即可使用成型 凝胶制备实验结果分析实验结果均匀性关系到实验的准确性凝胶的均匀性透明度影响到实验结果的观察和分析凝胶的透明度凝胶板的机械性能直接影响到实验的顺利进行凝胶板的机械性能 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶板制备板制备聚丙烯酰胺凝胶板是凝胶电泳中经常使用的材料之一。其制备步聚丙烯酰胺凝胶板是凝胶电泳中经常使用的材料之一。其制备步骤包括：配制缓冲液、浇注凝胶和成型。凝胶板的机械性能和透骤包括：配制缓冲液、浇注凝胶和

12、成型。凝胶板的机械性能和透明度都影响到实验结果的准确性和观察。明度都影响到实验结果的准确性和观察。几种不同种类凝胶的适用场景常用于核酸电泳和蛋白质电泳聚丙烯酰胺凝胶常用于细胞凋亡和血清蛋白质琼脂糖凝胶常用于大分子蛋白质电泳聚丙烯酰胺-琼脂糖复合凝胶常用于核糖体RNA电泳聚丙烯酰胺-琼脂糖-硼酸凝胶凝胶电泳实验的重要性凝胶电泳技术是生物学、生物化学和分子生物学中非常重要的实验技术之一。通过凝胶电泳实验，可以分离出DNA、RNA或蛋白质，从而进行分析和研究。凝胶制备是凝胶电泳实验中不可或缺的一步，不同种类的凝胶适用于不同的实验需求。适用场景适用场景核酸电泳和蛋白质电泳核酸电泳和蛋白质电泳细胞凋亡和

13、血清蛋白质细胞凋亡和血清蛋白质大分子蛋白质电泳大分子蛋白质电泳核糖体核糖体RNARNA电泳电泳分离效果分离效果较高较高较低较低较高较高较高较高凝胶的透明度凝胶的透明度较高较高较低较低较高较高较高较高不同种类凝胶的特点凝胶种类凝胶种类聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺-琼脂糖复合凝胶琼脂糖复合凝胶聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺-琼脂糖琼脂糖-硼酸凝胶硼酸凝胶保证实验环境干净整洁凝胶制备前要清洁实验台0103过早进行下一步操作会影响实验结果凝胶液浇注后要等待凝胶完全成型才能进行下一步操作02比例不准确会影响实验结果凝胶制备时要严格按照比例配制缓冲液 0505第5章 蛋白质电

14、泳 SDS-PAGESDS-PAGE的的详细解释详细解释SDS-PAGESDS-PAGE又称为又称为SDSSDS凝胶电泳，是一种蛋白质分子量测定方凝胶电泳，是一种蛋白质分子量测定方法。它的原理是将待测蛋白质样品添加到法。它的原理是将待测蛋白质样品添加到SDSSDS（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）缓冲液中，在蛋白质和缓冲液中，在蛋白质和SDSSDS缓冲液中加热不断磁力搅拌使蛋白质缓冲液中加热不断磁力搅拌使蛋白质样品中的蛋白质变性并带有等电点单位的负电荷，以便通过凝胶样品中的蛋白质变性并带有等电点单位的负电荷，以便通过凝胶电泳来把它们从分子量最大的开始向下分离出来。电泳来把它们从分子量最大的开

15、始向下分离出来。SDS-PAGE的原理IEF等电聚焦点电泳分子量分子量筛选电场电泳过程中的电场 SDS-PAGE步骤包括蛋白质样品的制备和去除胶体杂质样品处理加样、电泳水平电泳电泳结束后，将凝胶在垂直方向转移垂直电泳 SDS-PAGE实验注意事项凝胶和缓冲液的配比比例如加样量，电泳时间，转移时间等注意事项 SDS-PAGESDS-PAGE实实验结果分析验结果分析SDS-PAGESDS-PAGE凝胶照片的分析可以确定分子量、纯度、含量和组凝胶照片的分析可以确定分子量、纯度、含量和组成等信息。蛋白质分子量的计算需要使用蛋白质标准品和相应的成等信息。蛋白质分子量的计算需要使用蛋白质标准品和相应的分子

16、量标记条带来确定。蛋白质的鉴定则可以通过分子量标记条带来确定。蛋白质的鉴定则可以通过Western Western blottingblotting法或质谱等方法来进行。法或质谱等方法来进行。适用于检测样品中不同大小和形态的蛋白质分离效率高0103能够检测到微量或低浓度的蛋白质灵敏性高02只要熟悉实验步骤，就可以进行准确鉴定操作简单电泳过程电泳过程加样时用微量移液器、盖子或加样时用微量移液器、盖子或贴纸，注意不要将样品溢出凝贴纸，注意不要将样品溢出凝胶或进入附近的孔隙中胶或进入附近的孔隙中调节电源时，一定要注意电极调节电源时，一定要注意电极和冷凝器的连接和冷凝器的连接每次加样前应当重新开机，同

17、每次加样前应当重新开机，同时要清洗冷凝器和电源内部的时要清洗冷凝器和电源内部的电极电极数据分析数据分析计算分子量时，可以利用软件计算分子量时，可以利用软件对分子量标记物的条带进行测对分子量标记物的条带进行测量和分析量和分析鉴定蛋白质时，可以利用其他鉴定蛋白质时，可以利用其他实验方法进行验证或补充实验方法进行验证或补充维护凝胶仪维护凝胶仪清洗凝胶仪时，要注意内部杂清洗凝胶仪时，要注意内部杂质和残留物的清洗质和残留物的清洗凝胶仪储存时，应当放在干燥、凝胶仪储存时，应当放在干燥、阴凉、通风的地方阴凉、通风的地方定期检查凝胶仪的电源和工作定期检查凝胶仪的电源和工作状态，防止故障状态，防止故障SDS-P

18、AGE实验注意事项凝胶制备凝胶制备制备凝胶前用制备凝胶前用70%70%酒精擦净平酒精擦净平板和模具板和模具制备凝胶的时候要注意去泡沫制备凝胶的时候要注意去泡沫和内部有无气泡和内部有无气泡制备凝胶好后，用透明胶粘在制备凝胶好后，用透明胶粘在平板上，注意不要搞错左右、平板上，注意不要搞错左右、上下和前后上下和前后 0606第6章 总结 本次实验的意义SDSPAGE凝胶电泳技术原理蛋白质的电泳技术学习SDSPAGE凝胶电泳技术的操作步骤本次实验的收获熟悉SDSPAGE凝胶电泳技术的异常情况与解决方案 实验流程回顾制备SDSPAGE凝胶流程回顾电泳操作步骤蛋白质染色与成像SDSPAGE凝胶制备中的问题

19、及解决方案难点和解决方案制备缓冲液和凝胶溶液制备SDSPAGE凝胶0103电泳操作02注入凝胶溶液和堆样解决方案解决方案增加凝胶浓度增加凝胶浓度调整电泳电压和时间调整电泳电压和时间调整凝胶调整凝胶pHpH值值 SDSPAGE凝胶电泳常见异常情况及解决方案异常情况异常情况凝胶出现裂缝凝胶出现裂缝蛋白质带发生偏移蛋白质带发生偏移带宽过宽或过窄带宽过宽或过窄参考文献1.Sambrook,J.,&Russell,D.W.(2001).Molecular cloning:a laboratory manual(Vol.1,No.4).Cold Spring Harbor Laboratory Press

20、.2.Laemmli,U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature,227(5259),680-685.3.Gasteiger,E.,Hoogland,C.,Gattiker,A.,Duvaud,S.,Wilkins,M.R.,Appel,R.D.,&Bairoch,A.(2005).Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.In The proteomi

21、cs protocols handbook(pp.571-607).Humana Press.致谢感谢指导老师的辅导和实验室同事的支持 0707第7章 附录 SDS-PAGESDS-PAGE凝凝胶电泳原理图胶电泳原理图SDS-PAGESDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。其基本原凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。其基本原理是：用理是：用SDSSDS使蛋白质带电并且消除其在电泳中的电荷影响，使使蛋白质带电并且消除其在电泳中的电荷影响，使其仅由分子量来决定其迁移速率。其仅由分子量来决定其迁移速率。SDS-PAGESDS-PAGE凝凝胶板结构示意图胶板结构示意图SDS-PAGESDS

22、-PAGE凝胶电泳板的结构示意图，它包括两个主要部分：凝胶电泳板的结构示意图，它包括两个主要部分：上部的样品孔和下部的电极块。上部的样品孔和下部的电极块。SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。什么是SDS-PAGE凝胶电泳？0103SDS-PAGE凝胶电泳可用于蛋白质分离、纯化和定量，是蛋白质研究的重要工具。SDS-PAGE凝胶电泳的应用02首先，需要将待测样品与SDS加热混合，使之变性。之后，将变性后的样品加入凝胶孔中，进行电泳操作。如何进行SDS-PAGE凝胶电泳？蛋白质分子量计算公式分子量 116 (载体迁移距离-追踪染料前端距离)+14SDS-PAGE凝胶电泳分子量计算公

23、式分子量=100 色带迁移距离/总迁移距离PAGE凝胶电泳分子量计算公式分子量=2.4 109/迁移距离尿素PAGE凝胶电泳分子量计算公式 蛋白质浓度计算公式蛋白质浓度(mg/mL)=(吸光度 稀释倍数)/系数BCA法测定蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=(吸光度-空白对照吸光度)/标准曲线斜率Lowry法测定蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=(吸光度-空白对照吸光度)/标准曲线斜率Bradford法测定蛋白质浓度 对样品的安全要求对样品的安全要求样品需先进行消毒处理样品需先进行消毒处理禁止将样品直接倒入下水道禁止将样品直接倒入下水道对对仪仪器器设设备备的的安安全全要要求求仪器设备必须经过专业人员培仪器设备必须经过专业人员培训才能使用训才能使用使用过程中禁止随意拆卸仪器使用过程中禁止随意拆卸仪器部件部件对对实实验验人人员员的的安安全全要要求求实验人员必须持证上岗实验人员必须持证上岗实验操作前必须进行详细的安实验操作前必须进行详细的安全培训全培训实验室安全规定实实验验室室基基本本安安全全要要求求使用化学品时必须佩戴防护眼使用化学品时必须佩戴防护眼镜和手套镜和手套实验结束后必须清理实验台和实验结束后必须清理实验台和仪器设备仪器设备 谢谢观看！下次再见