中图版高中生物必修蛋白质的结构与功能pptty省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

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1、目目 录录蛋白质结构与功效蛋白质结构与功效Structure and Function of Protein第1页目目 录录一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质?蛋蛋白白质质(protein)是是由由许许多多氨氨基基酸酸(amino acids)经经过过肽肽键键(peptide bond)相相连连形形成成高高分子含氮化合物。分子含氮化合物。第2页目目 录录二、蛋白质生物学主要性二、蛋白质生物学主要性1.蛋白质是生物蛋白质是生物 体主要组成成份体主要组成成份分分布布广广：全全部部器器官官、组组织织都都含含有有蛋蛋白白质质；细胞各个部分都含有蛋白质。细胞各个部分都含有蛋白质。含含量量高高：蛋蛋白白质质

2、是是细细胞胞内内最最丰丰富富有有机机分分子子，占占人人体体干干重重45，一一些些组组织织含含量量更更高高，比如脾、肺及横纹肌等高达比如脾、肺及横纹肌等高达80。第3页目目 录录1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调整作用）代谢调整作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质转运和存放）物质转运和存放5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）参加细胞间信息传递）参加细胞间信息传递2.蛋白质含有主要生物学功效蛋白质含有主要生物学功效3.氧化供能氧化供能第4页目目 录录蛋蛋 白白 质质 分分 子子 组组 成成The Molecular Component of Pr

3、otein第第 一一 节节第5页目目 录录 组成蛋白质元素组成蛋白质元素主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少许有些蛋白质含有少许磷磷或金属元素或金属元素铁、铁、铜、锌、锰、钴、钼铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘。第6页目目 录录 各种蛋白质含氮量很靠近，平均为各种蛋白质含氮量很靠近，平均为16。因因为为体体内内含含氮氮物物质质以以蛋蛋白白质质为为主主，所所以以，只只要要测测定定生生物物样样品品中中含含氮氮量量，就就能能够够依依据据以以下下公式推算出蛋白质大致含量：公式推算出蛋白质大致含量：100克样品中蛋白质含量克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克

4、数每克样品含氮克数 6.251001/16%蛋白质元素组成特点蛋白质元素组成特点第7页目目 录录一、氨基酸一、氨基酸 组成蛋白质基本单位组成蛋白质基本单位存存在在自自然然界界中中氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，且且均均属属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。第8页目目 录录H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸通式氨基酸通式R第9页目目 录录1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸分类（一）氨基酸分类*20*20种氨基酸

5、英文名称、缩写符号及分类以下种氨基酸英文名称、缩写符号及分类以下:第10页目目 录录甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸目目 录录第11页目目 录录色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89丝氨酸丝氨酸

6、serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602.极性中性氨基酸极性中性氨基酸目目 录录第12页目目 录录天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys

7、 K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸目目 录录第13页目目 录录几个特殊氨基酸几个特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）第14页目目 录录 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH第15页目目 录录（二）氨基酸理化性质（二）氨基酸理化性质1.两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液酸碱度。于所处溶液酸碱度。等电点等电点(isoelectric point,pI)在在某某一一

8、pH溶溶液液中中，氨氨基基酸酸解解离离成成阳阳离离子子和和阴阴离离子子趋趋势势及及程程度度相相等等，成成为为兼兼性性离离子子，呈呈电电中中性性。此此时时溶溶液液pH值值称称为为该该氨基酸氨基酸等电点等电点。第16页目目 录录pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸兼性离子氨基酸兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子第17页目目 录录2.紫外吸收紫外吸收 色氨酸、酪氨酸最色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在大吸收峰在 280 nm 附附近。近。大大多多数数蛋蛋白白质质含含有有这这两两种种氨氨基基酸酸残残基基，所所以以 测测 定定 蛋蛋 白白 质质 溶溶 液液280nm光光吸吸收收值值是是分分

9、析析溶溶液液中中蛋蛋白白质质含含量量快快速速简便方法。简便方法。芳香族氨基酸紫外吸收芳香族氨基酸紫外吸收第18页目目 录录3.茚三酮反应茚三酮反应 氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮水水合合物物共共热热，可可生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物，其其最最大大吸吸收收峰峰在在570nm处处。因因为为此此吸吸收收峰峰值值与与氨氨基基酸酸含含量量存存在在正正比比关关系，所以可作为氨基酸定量分析方法。系，所以可作为氨基酸定量分析方法。第19页目目 录录二、肽二、肽*肽肽键键(peptide bond)是是由由一一个个氨氨基基酸酸-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸-氨氨基基脱脱水水缩缩合合而而形形成成化学键。

10、化学键。（一）肽（一）肽(peptide)第20页目目 录录+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键第21页目目 录录*肽肽是由氨基酸经过肽键缩合而形成化合是由氨基酸经过肽键缩合而形成化合物。物。*两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨基酸缩合则形成基酸缩合则形成三肽三肽*肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而基团不肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成肽称为由十个以内氨基酸相连而成肽称为寡肽寡肽(oligopeptide)，由更多氨基酸相连形成肽由更多氨基酸相连形成肽称称多肽多肽(poly

11、peptide)。第22页目目 录录N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基一端一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基一端一端多肽链有两端多肽链有两端*多多肽肽链链(polypeptide chain)是是指指许许多多氨氨基酸之间以肽键连接而成一个结构。基酸之间以肽键连接而成一个结构。第23页目目 录录N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶第24页目目 录录（二）（二）几个生物活性肽几个生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)第25页目目 录录GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NAD

12、PH+H+NADP+第26页目目 录录 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽第27页目目 录录三、蛋白质分类三、蛋白质分类 *依据蛋白质组成成份依据蛋白质组成成份 单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分蛋白质部分+非蛋白质部分非蛋白质部分*依据蛋白质形状依据蛋白质形状 纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质第28页目目 录录蛋蛋 白白 质质 分分 子子 结结 构构The Molecular Structure of Protein 第第 二二 节节第29页目目 录录蛋白质分子结构包

13、含蛋白质分子结构包含 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构第30页目目 录录定义定义蛋白质一级结构指多肽链中氨基酸排列次序。蛋白质一级结构指多肽链中氨基酸排列次序。一、蛋白质一级结构一、蛋白质一级结构主要化学键主要化学键肽键肽键，有些蛋白质还包含二硫键。，有些蛋白质还包含二硫键。第31页一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功效基础。功效基础。目目 录录第

14、32页目目 录录二、蛋白质二级结构二、蛋白质二级结构蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一段段肽肽链链局局部部空空间间结结构构，即即该该段段肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子相相对对空空间间位位置，并不包括氨基酸残基侧链构象置，并不包括氨基酸残基侧链构象。定义定义 主要化学键主要化学键：氢键氢键 第33页目目 录录（一）肽单元（一）肽单元参参加加肽肽键键6个个原原子子C 1、C、O、N、H、C 2位位于于同同一一平平面面，C 1和和C 2在在平平面面上上所所处处位位置置为为反反式式(trans)构构型型，此此同同一一平平面面上上6个个原原子子组组成成了了所所谓谓肽肽单单元元(peptide unit)

15、。第34页目目 录录 蛋白质二级结构主要形式蛋白质二级结构主要形式 -螺旋螺旋 (-helix)-折叠折叠 (-pleated sheet)-转角转角 (-turn)无规卷曲无规卷曲 (random coil)第35页（二）（二）-螺旋螺旋目目 录录第36页目目 录录（三）（三）-折叠折叠第37页目目 录录（四）（四）-转角和无规卷曲转角和无规卷曲-转角转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性那部分无规卷曲是用来阐述没有确定规律性那部分肽链结构。肽链结构。第38页目目 录录（五）模体（五）模体在许多蛋白质分子中，可发觉二个或在许多蛋白质分子中，可发觉二个或三个含有二级结构肽段，在空间上相互靠三个含

16、有二级结构肽段，在空间上相互靠近，形成一个特殊空间构象，被称为模体近，形成一个特殊空间构象，被称为模体(motif)。第39页目目 录录钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子模体合钙离子模体 锌指结构锌指结构 第40页目目 录录（六）氨基酸残基（六）氨基酸残基侧链对侧链对二二级结级结构形成影构形成影响响蛋白质二级结构是以一级结构为基础。一蛋白质二级结构是以一级结构为基础。一段肽链其氨基酸残基侧链适合形成段肽链其氨基酸残基侧链适合形成-螺旋或螺旋或-折折叠，它就会出现对应二级结构。叠，它就会出现对应二级结构。第41页目目 录录三、蛋白质三级结构三、蛋白质三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键

17、、氢键和 Van der Waals力等。力等。主要化学键主要化学键整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置。即肽链中全部原子在三维空间排布位置。即肽链中全部原子在三维空间排布位置。（一）（一）定义定义 第42页目目 录录第43页目目 录录 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端第44页目目 录录纤连蛋白分子结构域纤连蛋白分子结构域 （二）结构域（二）结构域大分子蛋白质三级结构常可分割成一个或数大分子蛋白质三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状区域，折叠得较为紧密，各行使个球状或纤维状区域，折叠得较为紧密，各行使其功效，称为结构域其功效，称为结构域(dom

18、ain)。第45页目目 录录（三）分子伴侣（三）分子伴侣分子伴侣分子伴侣(chaperon)经过提供一个保护环境从经过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠整天然构象或形成四级结构。而加速蛋白质折叠整天然构象或形成四级结构。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段疏水部分结合随即分子伴侣可逆地与未折叠肽段疏水部分结合随即松开，如此重复进行可预防错误聚集发生，使肽松开，如此重复进行可预防错误聚集发生，使肽链正确折叠。链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集肽段结合，使之解聚后，分子伴侣也可与错误聚集肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键正确形分子伴侣在蛋白质

19、分子折叠过程中二硫键正确形成起了主要作用。成起了主要作用。第46页目目 录录亚基之间结协力主要是疏水作用，其次是亚基之间结协力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。氢键和离子键。四、蛋白质四级结构四、蛋白质四级结构蛋白质分子中各亚基空间排布及亚基接触蛋白质分子中各亚基空间排布及亚基接触部位布局和相互作用，称为部位布局和相互作用，称为蛋白质四级结构蛋白质四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整三级结构，称为蛋白质每一条多肽链都有完整三级结构，称为蛋白质亚基亚基 (subunit)。第47页目目 录录血红蛋白血红蛋白四级结构四级结构 第4

20、8页目目 录录蛋白质结构与功效关系蛋白质结构与功效关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节第49页目目 录录（一）一级结构是空间构象基础（一）一级结构是空间构象基础 一、蛋白质一级结构与功效关系一、蛋白质一级结构与功效关系 牛核糖核酸酶一牛核糖核酸酶一级结构级结构二二硫硫键键第50页目目 录录 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第51页目目 录录（二）一级结构与功效关系（二）一级结构与功效关系例：镰刀形红

21、细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)这种由蛋白质分子发生变异所造成疾病，这种由蛋白质分子发生变异所造成疾病，称为称为“分子病分子病”。第52页目目 录录（一）肌红蛋白与血红蛋白结构（一）肌红蛋白与血红蛋白结构 二、蛋白质空间结构与功效关系二、蛋白质空间结构与功效关系 目目 录录第53页目目 录录Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb百百分分数

22、（称数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度改变而改变。浓度改变而改变。（二）血红蛋白构象改变与结合氧（二）血红蛋白构象改变与结合氧 第54页目目 录录肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)氧解离曲线氧解离曲线第55页目目 录录*协同效应协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质一个亚基与其配体结合后，一个寡聚体蛋白质一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力现能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力现象，称为象，称为协同效应协同效应。假如是促进作用则称为假如是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)

23、假如是抑制作用则称为假如是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)第56页目目 录录第57页目目 录录O2血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环小小孔孔中中，继继而而引发肽链位置变动。引发肽链位置变动。第58页目目 录录变构效应变构效应(allosteric effect)蛋蛋白白质质空空间间结结构构改改变变伴伴随随其其功功效效改变，称为改变，称为变构效应变构效应。第59页目目 录录（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质折折叠叠发发生生

24、错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功效效，严严重重时时可可造造成成疾疾病发生。病发生。第60页目目 录录蛋白质构象改变造成疾病机理蛋白质构象改变造成疾病机理：有些蛋白：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀病理改变。白质淀粉样纤维沉淀病理改变。这类疾病包含这类疾病包含：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、

25、疯牛病等。第61页目目 录录疯牛病中蛋白质构象改变疯牛病中蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引发一组人和动物神经退行性病变。引发一组人和动物神经退行性病变。正常正常PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质作用下可转变成全为在某种未知蛋白质作用下可转变成全为-折叠折叠PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第62页目目 录录第四节第四节蛋白质理化性质与分离纯化蛋白质理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters a

26、nd Separation and Purification of Protein第63页目目 录录（一）蛋白质两性电离（一）蛋白质两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中一一些些基基团团，在在一一定定溶溶液液pHpH条条件件下下都可解离成带负电荷或正电荷基团。都可解离成带负电荷或正电荷基团。*蛋白质等电点蛋白质等电点(isoelectric point,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子

27、，净净电电荷荷为零，此时溶液为零，此时溶液pH称为称为蛋白质等电点。蛋白质等电点。第64页目目 录录（二）蛋白质胶体性质（二）蛋白质胶体性质 蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子直直径径可可达达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定原因蛋白质胶体稳定原因颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜第65页目目 录录+带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质在等电点蛋白质在等电点蛋白质水化膜水化膜+带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质不稳定蛋白质颗粒不稳定蛋白质颗粒酸

28、酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质聚沉溶液中蛋白质聚沉第66页目目 录录（三）蛋白质变性、沉淀和凝固（三）蛋白质变性、沉淀和凝固 *蛋白质变性蛋白质变性(denaturation)在一些物理和化学原因作用下，其特定空在一些物理和化学原因作用下，其特定空间构象被破坏，也即有序空间结构变成无序空间构象被破坏，也即有序空间结构变成无序空间结构，从而造成其理化性质改变和生物活性间结构，从而造成其理化性质改变和生物活性丧失。丧失。第67页目目 录录 造成变性原因造成变性原因如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及

29、生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等。变性本质变性本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质一级结构。质一级结构。第68页目目 录录 应用举例应用举例临床医学上，变性原因常被应用来消毒及临床医学上，变性原因常被应用来消毒及灭菌。灭菌。另外另外,预防蛋白质变性也是有效保留蛋白质预防蛋白质变性也是有效保留蛋白质制剂（如疫苗等）必要条件。制剂（如疫苗等）必要条件。第69页目目 录录若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性原原因因后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有构构象象和功效，称为和功效，称为复性复性(renaturat

30、ion)。第70页目目 录录 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第71页目目 录录*蛋白质沉淀蛋白质沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀淀，但并不变性。但并不变性。*蛋白质凝固作用蛋白质凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后絮状物加热可变成比较坚固凝蛋白质变性后絮状

31、物加热可变成比较坚固凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。第72页目目 录录（四）蛋白质紫外吸收（四）蛋白质紫外吸收因因为为蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，所所以以在在280nm波波优优点点有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，所所以以可可作作蛋蛋白质定量测定。白质定量测定。第73页目目 录录（五）蛋白质呈色反应（五）蛋白质呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生氨基酸也可发生茚三蛋白质经水解后产生氨基酸也可发生茚三酮反

32、应。酮反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，展现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，展现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。第74页目目 录录二、蛋白质分离和纯化二、蛋白质分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法*透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开方法。开方法。*超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离

33、心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。第75页目目 录录（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量普普通通10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应马马上上分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。*盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面

34、电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，造造成成蛋蛋白白质质沉沉淀。淀。第76页目目 录录*免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物可取得抗该蛋白特异抗体。利用特异抗体可取得抗该蛋白特异抗体。利用特异抗体识别对应抗原蛋白，并形成抗原抗体复合识别对应抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物性质，可从蛋白质混合溶液中分离取得物性质，可从蛋白质混合溶液中分离取得抗原蛋白。抗原蛋白。第77页目目 录录（三）电泳（三）电泳蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pIpI溶溶液液中中为为带带电电颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种经经

35、过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而到到达达分分离离各各种种蛋蛋白白质质技技术术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。依依据据支支撑撑物物不不一一样样，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶电泳等。胶电泳等。第78页目目 录录几个主要蛋白质电泳几个主要蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，惯用于蛋白质，惯用于蛋白质分子量测定。分子量测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，经过蛋白质等电点差异而，经过蛋白质等电点差异而分离蛋白质电泳方法。分离蛋白质电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究主要技术。是蛋白质组学研究主要技术。第79页目目 录录（四）层析

36、（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质原理分离蛋白质原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，依据溶液中待分离蛋白态物质（固定相）时，依据溶液中待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白质组分在两相中重复分配，并以不一样速蛋白质组分在两相中重复分配，并以不一样速度流经固定相而到达分离蛋白质目标度流经固定相而到达分离蛋白质目标 。第80页目目 录录蛋白质分离惯用层析方法蛋白质分离惯用层析方法*离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质电荷量及性质利用各蛋白质电荷量及性质不

37、一样进行分离。不一样进行分离。*凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利用用各各蛋白质分子大小不一样分离。蛋白质分子大小不一样分离。第81页目目 录录第82页目目 录录第83页目目 录录（五）超速离心（五）超速离心*超超速速离离心心法法(ultracentrifugation)既既能能够够用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也能能够够用用作作测测定定蛋蛋白白质质分分子量。子量。*蛋蛋 白白 质质 在在 离离 心心 场场 中中 行行 为为 用用 沉沉 降降 系系 数数(sedimentation coefficient,S)表表示示,沉沉降降系系数与

38、蛋白质密度和形状相关数与蛋白质密度和形状相关。第84页目目 录录因因为为沉沉降降系系数数S大大致致上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状高高度度不不对对称称大大多多数数纤纤维维状状蛋白质不适用。蛋白质不适用。第85页目目 录录三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质氨基酸残基组成测定多肽链氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段氨基酸

39、排列次序，普通采取测定各肽段氨基酸排列次序，普通采取Edman降解法降解法普通需用数种水解法，并分析出各肽段中氨基酸次普通需用数种水解法，并分析出各肽段中氨基酸次序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸次序结果。酸次序结果。第86页目目 录录经过核酸来推演蛋白质中氨基酸序列经过核酸来推演蛋白质中氨基酸序列按照三联密码标准推演出氨基酸序列按照三联密码标准推演出氨基酸序列分离编码蛋白质基因分离编码蛋白质基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列第87页目目 录录四、蛋白质空间结构测定四、蛋白质空间结构测定*二级结构测定二级结构测

40、定通通常常采采取取圆圆二二色色光光谱谱(circular dichroism，CD)测测定定溶溶液液状状态态下下蛋蛋白白质质二二级级结结构构含含量量。-螺螺旋旋CDCD峰峰有有222nm222nm处处负负峰峰、208nm208nm处处负负峰峰和和198 198 nmnm处正峰三个成份；而处正峰三个成份；而-折叠折叠CDCD谱不很固定。谱不很固定。第88页目目 录录*三级结构测定三级结构测定X射射线线衍衍射射法法(X-ray diffraction)和和核核磁磁共共振振技技术术(nuclear magnetic resonance,NMR)是是研研究蛋白质三维空间结构最准确方法。究蛋白质三维空间结构最准确方法。第89页目目 录录*用用分分子子力力学学、分分子子动动力力学学方方法法，依依据据物物理理化化学学基基本本原原理理，从从理理论论上上计计算算蛋蛋白白质质分分子子空空间间结结构。构。依据蛋白质氨基酸序列预测其三维空间结构依据蛋白质氨基酸序列预测其三维空间结构*经经过过对对已已知知空空间间结结构构蛋蛋白白质质进进行行分分析析，找找出出一一级级结结构构与与空空间间结结构构关关系系，总总结结出出规规律律，用用于新蛋白质空间结构预测。于新蛋白质空间结构预测。第90页