重组干扰素.ppt

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1、重组干扰素重组干扰素Recombinant Interferon1Alick和和Jean发现干扰素发现干扰素病毒感染的细胞能产生一种因子作用于其他细胞并干扰病毒的复制。19572什么是干扰素什么是干扰素https:/en.wikipedia.org/wiki/Interferon(retrieved on January 3,2016)Passage Downloaded from http:/rspb.royalsocietypublishing.org/on December 29,20153Friedman发现发现干扰素抗病毒的作用机制干扰素抗病毒的作用机制抑制病毒的信使RNA功能196

2、6-19714干扰素的作用机制干扰素的作用机制FinlayMcNab,KatrinMayerBarber,AlanSher,AndreasWackandAnneOGarra“TypeIinterferonsininfectiousdisease”.Naturereviews.Immunology:87103.2015,2脊椎动物感染病毒体细胞脊椎动物感染病毒体细胞干扰素细胞因子干扰素细胞因子IFN激活激活ISGs(interferon stimulated genes)相邻细胞及受感染细胞相邻细胞及受感染细胞抗病毒蛋白抗病毒蛋白免疫细胞免疫细胞使细胞裂解使细胞裂解抗病毒抗体抗病毒抗体5干扰素干

3、扰素用于临床用于临床用纯化的人白细胞干扰素成功治疗2例慢性乙肝患者，但是由于人白细胞干扰素原材料来源有限，未能大量应用于临床。19766关于乙肝关于乙肝张焜和,乙肝病毒感染的基础与临床,江西科学技术出版社,1999年07月第1版,第34页高翔.乙肝病毒携带者健康歧视的法律规制研究D.福建:华侨大学,2007.嗜肝嗜肝DNA病毒：病毒：HBV本身无毒害：慢性发作：我国1.2亿乙肝病毒携带者顽强生命力引起免疫反应损坏肝脏干扰素治疗乙肝：干扰素治疗乙肝：抗病毒作用免疫调节作用抗纤维化作用7干扰素的分类及应用干扰素的分类及应用https:/en.wikipedia.org/wiki/Interfero

4、n(retrieved on January 3,2016)主要适应症：主要适应症：几乎能够抵抗所有病毒引起的感染目前主要用于乙肝乙肝、丙肝丙肝的治疗8获得获得重组干扰素重组干扰素科学家们用基因工程技术在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了重组人干扰素。19809资金来源多样化1999199919861986 2002200219961996 200220022003200319891989体外诱生制备:Sendai诱导人白细胞人源转化细胞系培养:多亚型混合干扰素基因工程E.Coli 发酵:重组人干扰素工程CHO细胞系构建动物无限细胞系培养假单胞杆菌工程菌发酵 IFN-n3批准上市工艺复杂 产量低:1

5、g=3亿ml 来源困难价格昂贵 潜在血源性病毒污染 IFN-n1/Wellferon 首次实现大规模商业化生产 活性低 退出临床应用无糖基化 无N-met 无活性包涵体166aa糖基化蛋白22.5 ku分泌表达产量低成本高过程严格IFN-2b/Alferon安福隆 无糖基化可溶性蛋白具有天然分子结构具有生物活性生产工艺的发展生产工艺的发展10甘乐能上市甘乐能上市世界上第一个重组人干扰素 IFN-2bIntron A由美国Schering Plough公司上市，被FDA批准于治疗慢性乙肝。198611甘乐能适适应应症症:本品用于慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎，肾细胞癌，恶性黑色素瘤等疾病的治疗。用法

6、用量：用法用量：皮下注射。不良反应：不良反应：常见为发热、疲乏、头痛和肌痛。禁禁忌忌：对重组干扰素-2b及其所含组分有过敏史的患者禁用。禁止使用本品和利巴韦林联合治疗。注注意意事事项项：本品含稳定剂间-苯甲酚，某些患者可对此发生过敏反应。详见说明书。一个重组干扰素的典型事例A specific example of recombinant IFN12生产工艺生产工艺制剂研究制剂研究给药方式给药方式市场分析市场分析研究进展研究进展131重组人干扰素生产工艺基因工程假单胞杆菌的构建与保藏基因工程假单胞杆菌的构建与保藏干扰素的发酵工艺过程干扰素的发酵工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工

7、艺过程产工艺14构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素干扰素-2b基因的克隆基因的克隆表达载体的构建工程菌的构建 制备白细胞病毒诱导分离mRNA反转录酶合成cDNA、PCRATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTT

8、CAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA

9、TGA参考文献：孔晓清，张忆疆.假单孢杆菌发酵生产-2b 干扰素工艺,2010 15构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素-2b基因的克隆表达载体的构建表达载体的构建工程菌的构建IFN基因连接质粒转化E.coli筛选鉴定阳性克隆测序：人人IFN-2b基因序列，基因序列，501bp，165aapVG3参考文献：元英进，制药工艺学，2007，P223 16构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素-2b基因的克隆表达载体的构建表达载体的构建工程菌的构建工程菌的构建 转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌

10、 获得原始菌种参考文献：元英进，制药工艺学，2007，P223 17构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库 具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。生化特性：Ser，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。工程菌的特征：SmR、TcR、ApR 具有生产干扰素能力18构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库加入甘油加入甘油 原始菌种原始菌种 传代扩增传代扩增 冻干保藏冻干保藏 QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。19

11、构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库主菌种库或上一代工作菌种库 OD值 8.0 种子 罐 培养摇瓶种子培养培养 基 Ependorf 管管 OD值 5.5 离 心 20构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化发酵过程发酵控制生生产产菌菌种种摇摇瓶瓶培培养养活活化化种种子子罐罐培培养养放放大大发发酵酵罐罐培培养养菌菌体体收收集集发发酵酵液液降降温温发发酵酵液液离离心心菌菌体体冷冷冻冻保保存存配制培养基配制培养基蒸汽灭菌蒸汽灭菌原料原料21构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化发酵过程发酵控制22构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化分离工艺

12、纯化工艺溶解粗干扰溶解粗干扰素素 沉淀与疏水沉淀与疏水层析层析阴离子交换阴离子交换层析与浓缩层析与浓缩阳离子交换阳离子交换层析与浓缩层析与浓缩凝胶过滤层凝胶过滤层析析无菌过滤分无菌过滤分装装检测菌体裂解菌体裂解预处理预处理初级分离初级分离23构建与保藏构建与保藏发酵发酵分离纯化分离纯化分离工艺纯化工艺溶解粗干扰溶解粗干扰素素 沉淀与疏水沉淀与疏水层析层析阴离子交换阴离子交换层析与浓缩层析与浓缩阳离子交换阳离子交换层析与浓缩层析与浓缩凝胶过滤层凝胶过滤层析析无菌过滤分无菌过滤分装装检测菌体裂解菌体裂解预处理预处理初级分离初级分离242制剂研究和给药方式干扰素注射制剂干扰素注射制剂鼻腔内给药系统鼻

13、腔内给药系统长效干扰素制剂长效干扰素制剂 产工艺产工艺25024487296120144168192时时间间(小时小时)干干扰扰素素浓浓度度 半衰期平均4小时1 血清干扰素浓度为零1 病毒重新出现2降低肾脏排泄 避免酶水解避免免疫细胞清除普通干扰素聚乙二醇化干扰素WHY PEGXu ZX,etal.Hepatology.1998;28(suppl):702A.Lam N,etal.Hepatology.1997;26:22631.26PEG分子量分子量 半衰期半衰期 抗病毒活性抗病毒活性高高(长长)低低(短短)30KD30KD5KD5KD12KD延长半衰期与保留活性之间的最佳平衡延长半衰期与保

14、留活性之间的最佳平衡WHY 1 12KD佩乐能27u1989-1999年，多亚型人天然干扰素混合物IFN-N3 和IFN-N1 获批上市。由于人天然干扰素因其产量低、活性低且具有潜在的血源性病毒污染等特点而逐渐退出市场。u1987年，Amgen公司生产的复合干扰素产品Infergen（重组集成干扰素注射液）获批上市，主要用于成年患者的慢性丙型肝炎治疗，不过其市场表现平平。u1990年，InterMune公司上市了第一个rh IFN-产品Actimmune，用于慢性肉芽肿病，重度恶性骨骼石化症等疾病的治疗。u1993年，Bayer公司上市第一个rh IFN-1b产品Betaseron，用于多发性

15、硬化症（MS）的治疗。u2001年，FDA批准Schering Plough公司的长效干扰素聚乙二醇IFN-2b，使得给药频率减少为1周1次。u2014年7月和8月，Biogen Idec公司的长效IFN-1a产品Plegridy（聚乙二醇干扰素-1a）获欧盟和FDA批准上市，用于治疗成人多发性硬化症（MS），其剂量为每两周一次。283市场分析和研究进展第二大重组蛋白第二大重组蛋白五巨头垄断全球市场五巨头垄断全球市场新型竞争药物冲击新型竞争药物冲击疾病谱差异疾病谱差异国内新药进展国内新药进展产工艺产工艺资料来源：FDA招商证券29第二大重组蛋白第二大重组蛋白干扰素干扰素长效rh-IFN短效rh

16、-IFNBiogen Idec公司：Avonex（IFN-1a）Merck Serono公司：Rebif（IFN-1a）Bayer公司：Betaferon/Betaseron（IFN-1b）Novartis公司：Extavia（IFN-1b）Roche公司：Pegasys（PEG IFN-2a）美国MSD公司：Peg-Intron（PEG IFN-2b）近期获批：Plegridy（聚乙二醇干扰素-1a）30第二大重组蛋白第二大重组蛋白2003-2013年重组干扰素在全球的销售额由45.1亿美元增加到91.5亿美元仅次于重组人胰岛素，为全球第二大重组蛋白药物，年复合增长率为7.33%。31五巨头

17、垄断全球干扰素市场五巨头垄断全球干扰素市场全球销售额为全球销售额为91.5亿美元亿美元:Biogen IdecMerck SeronoBayerRocheMSD2013年，前五大公司占据约98%市场份额，从产品的分类看：干扰素占据约79%份额，干扰素占据约21%。32受新型竞争药物冲击受新型竞争药物冲击两支长效干扰素成为丙肝和乙肝的一线用药。近年来，新的核苷类似物口服药物已占据乙肝用药主流，以Sovaldi为代表的突破性疗法的口服新药正在改变丙肝的治疗习惯。干扰素在MS治疗地位的产品。普通干扰素的升级Plegridy（聚乙二醇干扰素-1a）获批上市，有望成为干扰素市场重要推动力。33疾病谱差异

18、疾病谱差异导致国外导致国外IFN-国内国内IFN-全球干扰素市场中以复发型多发性硬化症为主要适应症的IFN-的市场占比逐年提高，而作为抗肝炎病毒的IFN-的市场份额却在逐年萎缩。如图6所示，国内基本以IFN-为主。34疾病谱差异疾病谱差异导致国外导致国外IFN-国内国内IFN-全球大约有250万人受MS的困扰。欧美发病率较高，中国发病率较低。欧美乙肝和丙肝感染人数较低，中国拥有全球数量最多的乙肝和丙肝患者，导致国内外干扰素产品结构差异较大。35国内干扰素新药的研发情况国内干扰素新药的研发情况u在长效干扰素这一领域中，通化东宝的子公司厦厦门门特特宝宝公公司司的产品进展速度最快，已于14年1月向国

19、家药监局申请生产；另外安安科科生生物物的长效干扰素新药也于14年6月获批临床试验，双双鹭鹭药药业业于14年4月申请临床试验。u在干扰素领域，目前还只有海正药业一家企业在开展新药研发工作，并于13年6月申请临床试验。3637 取保存工作种子批菌种，室温融化取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶活化培养：摇瓶活化培养：30，pH7.0，250 r/min，182h 检测：检测：OD值和发酵液杂菌检查。值和发酵液杂菌检查。干扰素生产工艺发酵工艺过程38 接种：接入接种：接入30L种子罐，接种量种子罐，接种量10%培养：培养：30，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速控制：级联调节通气量和搅拌转速

20、 DO为为30%，34h，OD4.0 检测：显微镜和检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。培养基划线检查，控制杂菌。干扰素生产工艺发酵工艺过程39 接种：通入接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量培养基的发酵罐，接种量 10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前前4h：30，pH7.0，DO为为30%4h后：后：20，pH6.0，DO为为60%，56.5h终点控制：终点控制：OD值达值达9.01.0，5冷却水快冷却水快 速降温至速降温至15以下以下 检测：发酵液杂菌检查检测：发酵液杂菌检查干扰素生产工艺发酵工艺过程40 连续流离心机：冷却的发酵液，连续流

21、离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。离心收集。菌体保存：菌体保存：20冰柜，不超过冰柜，不超过12个月。个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。质粒结构一致性、质粒稳定性。干扰素生产工艺发酵工艺过程41 种子培养基：种子培养基：C/N比较低的培养基比较低的培养基 发酵培养基：发酵培养基：C/N比较高的培养基比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系控制：加入缓冲体系干扰素生产工艺发酵工艺过程42 DO：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高 策略：加大

22、转速，增加通气量，必要时用纯氧策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧干扰素生产工艺发酵工艺过程43 温度：要考虑菌体生长和产物的积累温度：要考虑菌体生长和产物的积累 策略：前期控制在策略：前期控制在30，保证菌体快速生长，后期控制在，保证菌体快速生长，后期控制在 20积累产物，同时防止产物降解积累产物，同时防止产物降解干扰素生产工艺发酵工艺过程44 菌体生长：菌体生长：pH 6.8 产物积累：产物积累：pH 6.0 策策略：两段培养略：两段培养干扰素生产工艺发酵工艺过程45 裂解缓冲液：裂解缓冲液：纯化水，纯化水，210（pH7.5）使用保护剂：使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎

23、破碎-20菌体：菌体：2厘米厘米 搅拌：加裂解缓冲液，搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr 冻融冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。细胞完全破裂，释放干扰素。一定的pH条件下，细胞破裂，加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 而获得。而pH 环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液 提供。在一定的pH 环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。分离纯化工艺干扰素生产工艺46 加絮凝剂加絮凝剂聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺：210，搅拌，对菌体碎片，搅拌，对菌体碎片 进行絮凝。进行絮凝。加凝聚

24、剂醋酸钙溶液：加凝聚剂醋酸钙溶液：210,搅拌，对菌体碎搅拌，对菌体碎 片、片、DNA等进行沉淀。等进行沉淀。离心：离心：连续流离心机：连续流离心机：210，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。蒸汽灭菌，焚烧处理。菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得不到澄清的蛋白质分离纯化工艺干扰素生产工艺47 盐析盐析:4M硫酸铵，硫酸铵，210，搅匀静置过夜。，搅匀静置过夜。离心：连续流离心机，离心：连续流离心

25、机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，保存：收集沉淀，粗干扰素，4。分离纯化工艺干扰素生产工艺48 配制纯化缓冲液：超纯水，配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，0.45 m滤器和滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。检查：缓冲液的检查：缓冲液的pH值和电导值。值和电导值。溶解：溶解：210，匀浆，完全溶解。，匀浆，完全溶解。分离纯化工艺干扰素生产工艺49 等电点沉淀（等电点沉淀（1）：磷酸调节至）：磷酸调节至pH 5.0，沉淀杂蛋白，离，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。心收集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层

26、析柱中，疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中，除去非疏水性除去非疏水性蛋白。蛋白。洗脱与收集：洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH8.0）。）。分离纯化工艺干扰素生产工艺50 等电点沉淀（等电点沉淀（2）：磷酸调节）：磷酸调节pH4.5，调节，调节电导值电导值40 mS/cm，210，静置过夜，静置过夜 超滤：超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液透析除盐：调整溶液pH 8.0，10 ku超滤膜，超滤膜，0.005 M缓冲液。缓冲液。分离纯化工艺干扰素生产工艺51 0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂）平衡树脂 盐浓

27、度线性梯度盐浓度线性梯度550 mS/cm进行洗脱进行洗脱 配合配合SDS-PAGE收集干扰素峰收集干扰素峰 浓缩：调整溶液和电导，浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，超滤膜，0.05M醋酸缓冲醋酸缓冲液（液（pH5.0）中透析。）中透析。离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。DEAE（二乙胺乙基）等阴离子树脂侧链带正电荷，可与带负电（二乙胺乙基）等阴离子树脂侧链带正电荷，可与带负电荷的蛋白质结合；荷的蛋白质结合；CM（氯化聚乙烯（氯化聚乙烯）等阳离子树脂侧链带负电）等阳离子树脂侧链带负电荷，可与带正电荷的蛋白质结合。荷，可

28、与带正电荷的蛋白质结合。先用离子强度较低的缓冲液上样和洗脱，然后先用离子强度较低的缓冲液上样和洗脱，然后用离子强度高的缓冲液洗脱用离子强度高的缓冲液洗脱分离纯化工艺干扰素生产工艺52 用用0.1M醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度盐浓度线性梯度550 mS/cm进行洗脱进行洗脱 配合配合SDS-PAGE收集干扰素峰。收集干扰素峰。浓缩：浓缩：10 ku超滤膜进行。超滤膜进行。分离纯化工艺干扰素生产工艺53 洗涤液：洗涤液：0.15 M NaCl的的0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.0）清洗）清洗系统和树脂系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。上样，相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分合并干扰素部分分离纯化工艺干扰素生产工艺54 0.22 m滤膜过滤干扰素溶液滤膜过滤干扰素溶液 分装分装 20以下的冰箱中保存。以下的冰箱中保存。分离纯化工艺干扰素生产工艺55 干扰素鉴别试验干扰素鉴别试验 干扰素效价测定干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素其他：热原，内毒素，残留抗生素分离纯化工艺干扰素生产工艺56