男科学实验室诊断进展幻灯片.ppt

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1、男科学实验室诊断进展 1 1精液分析是评价男性生育能力的最精液分析是评价男性生育能力的最基本检验手段。理论上，精液分析是一基本检验手段。理论上，精液分析是一个很简单的操作过程，只要将一滴精液个很简单的操作过程，只要将一滴精液置于玻片上，进而确定其相关参数即可。置于玻片上，进而确定其相关参数即可。然而，实际上，精液分析所得的每一个然而，实际上，精液分析所得的每一个参数都需要大量的专业知识、细致认真参数都需要大量的专业知识、细致认真的操作及必要的质量控制措施。的操作及必要的质量控制措施。2 2KeelKeel等报告了美国纽约、哥伦比亚、洛山等报告了美国纽约、哥伦比亚、洛山矶、明尼苏达几百家男科实验

2、室对精子密度、矶、明尼苏达几百家男科实验室对精子密度、形态学、活率及抗精子抗体的室间质量控制结形态学、活率及抗精子抗体的室间质量控制结果，精子密度的结果显示，一份精液标本的精果，精子密度的结果显示，一份精液标本的精子密度差异范围达子密度差异范围达3 4923 49210106 6/ml/ml，手工检，手工检测的变异系数（测的变异系数（CVCV）为）为30%138%30%138%，计算机辅，计算机辅助的精液分析（助的精液分析（CASACASA）的）的CVCV为为24%99%24%99%。不同。不同实验室精子密度的较大差异提示，精子计数方实验室精子密度的较大差异提示，精子计数方法的不同、计数池种类

3、的不同以及操作的标准法的不同、计数池种类的不同以及操作的标准化对精子计数结果有着直接的影响。化对精子计数结果有着直接的影响。3 3一、精液常规检查 1、精液检测工具不断更新 （1 1）血细胞计数板）血细胞计数板 沿用沿用5050余年余年 （2 2）MaklerMakler精精子子计计数数板板 19781978年年以以色色列列MaklerMakler发明发明 （3 3）MacroMacro精子计数板精子计数板 （4 4）MicrocellMicrocell计计数数池池 19901990年年 GinaburyGinabury和和ArmandArmand发明发明 一次性使用一次性使用 （5 5）20

4、042004年年，美美国国Millennium Millennium SciencesSciences公公司司Cell-VUCell-VU精精子子记记数数池池和和Cell-VUCell-VU预预染染色色形形态态载载波片。波片。4 4计算机辅助的精液分析计算机辅助的精液分析 80年代发展的新技术，除可分析精子密度、活动百分率等指标外，在分析精子运动能力方面显示了其独特的优越性。5 56 67 78 89 9101011111212全自动精子分析仪（以色列）Medical Electronic Systems1313用已知浓度的乳胶珠溶液用已知浓度的乳胶珠溶液对目前国际上常用的种精子计对目前国际上

5、常用的种精子计数池进行了评价。数池进行了评价。种精子计数池的质量评估种精子计数池的质量评估14141 1 材料与方法材料与方法1.1 1.1 实验材实验材料料 uCell-VU计数池计数池（Millennium Sciences IncMillennium Sciences Inc，New YorkNew York，USAUSA）uMakler计数池计数池（Sefi-Medical InstrumentSefi-Medical Instrument，HaifaHaifa，IsraelIsrael）u血球计数池血球计数池（上海求精生化试剂仪器有限公司）上海求精生化试剂仪器有限公司）u标准乳胶珠溶

6、液标准乳胶珠溶液（Hamilton Thorne BiosciencesHamilton Thorne Biosciences，USAUSA）2份，浓度分别为：u（355）106/ml，（182.5）106/ml。15151.1.方法方法1.2.1 Cell-VU计数法1.2.2 Makler计数法 1.2.3 血球计数池法 1.1.统计学分析统计学分析 不同计数池的计数结果以不同计数池的计数结果以x xs s表示，表示，样本均数的比较采用样本均数的比较采用t t检验检验 16162 2 结果结果ChambernConcentration forstandard solution 1Conce

7、ntration forstandard solution 2Cell-VU3037.634.8918.221.77Hemacytometer3042.744.98*20.481.56*Makler1553.526.67*24.974.75*表表1 不同精子计数池的乳胶珠浓度不同精子计数池的乳胶珠浓度与Cell-VU计数池相比，*：P0.001；与血球计数池相比，：P1106/ml，可诊断为白细胞精子症 白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧（ROS）、分泌一些细胞因子等途径使精子损伤。精液中粒细胞为产生ROS的主要细胞。2525精液中白细胞的检测方法；1 1、对、对ROSROS的检测：依赖鲁米诺的

8、化学发光分析法的检测：依赖鲁米诺的化学发光分析法2 2、直接镜检法、直接镜检法 3 3、瑞、瑞-姬染色或巴氏染色法染色姬染色或巴氏染色法染色 4 4、过氧化物酶染色法（正甲苯胺兰、联苯胺及邻甲、过氧化物酶染色法（正甲苯胺兰、联苯胺及邻甲苯胺过氧化物酶染色）苯胺过氧化物酶染色）5 5、荧光原位杂交法、荧光原位杂交法 6 6、免疫细胞化学法、免疫细胞化学法 CD45CD45，CD4CD4，CD8CD87 7、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶、IL-8IL-8及溶菌酶测定及溶菌酶测定 2626四、免疫性不育的检测 检检测测方方法法很很多多，3 3种种类类别别的的抗抗精精子子抗抗体体均均可可测测，检检测测的的抗

9、抗精精子子抗抗体体为为总总的的或或各各种种类类别别的的抗抗精精子子膜膜抗抗原原的的抗抗体体，而而精精子子膜膜与与人人体体其其他他器器官官组组织织的的细细胞胞膜膜有有许许多多共共同同抗抗原原，因因而而这这种种抗抗原原抗抗体体反反应应的的特特异异性性不不高高。如如果果用用针针针针对对对对精精精精子子子子或或或或睾睾睾睾丸丸丸丸特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗原原原原，或或或或针针针针对对对对与与与与透透透透明明明明带带带带识识识识别别别别和和和和结结结结合合合合有有有有关关关关的的的的抗抗抗抗原原原原作作作作为为为为包包包包被被被被抗抗抗抗原原原原来来检检测测AsAbAsAb，其临床意义就会很大。

10、，其临床意义就会很大。NazNaz等等用用现现代代分分子子生生物物学学技技术术确确定定，受受精精抗抗原原FA-1FA-1和和YLPYLP（1212）具具有有此此特特性性，并并且且它它们们的的抗抗体体存存在在于于不不育育男男性性的的精精浆浆和和血血清清中中建建立立这这种种特特异异性性诊诊断断方方法法是是今今后后取取代代总总AsAbAsAb检检测测的的唯一途径。唯一途径。2727五、生殖道感染的检测生殖道感染的检测 大大肠肠杆杆菌菌、葡葡萄萄球球菌菌、链链球球菌菌、绿绿脓脓杆杆菌菌、淋淋球球菌菌、肺肺炎炎克克雷雷伯伯氏氏菌菌、结结核核杆杆菌菌、衣衣原原体体、支支原原体体、单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒、

11、人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒、腺腺相相关关病病毒毒、阴阴道道毛毛滴滴虫虫等等皆皆可可感感染生殖道，而且可致不育。染生殖道，而且可致不育。各各种种细细菌菌感感染染，往往往往通通过过菌菌体体本本身身及及其其释释放放出出的的毒毒素素、酶类等影响精子质量酶类等影响精子质量 病病毒毒的的感感染染更更为为隐隐蔽蔽临临床床实实验验室室多多用用ELISAELISA法法检检测测各各种种病病毒毒的的抗抗体体，通通过过抗抗体体的的分分型型可可粗粗略略判判断断病病毒毒的的感感染染时时期期 2828衣衣原原体体和和支支原原体体感感染染被被认认为为是是最最常常见见的的性性传传播播疾疾病（病（STDSTD）病原）病原与与男男性

12、性不不育育密密切切相相关关的的衣衣原原体体为为沙沙眼眼衣衣原原体体（CTCT），其其可可引引起起急急性性附附睾睾炎炎和和慢慢性性前前列列腺腺炎炎等等。目目前前，检检测测沙沙眼眼衣衣原原体体感感染染的的方方法法主主要要有有金金标标法法、ELISAELISA法法及及培培养养法法，尤尤以以ELISAELISA法法最最为为常用常用与与男男性性不不育育密密切切相相关关的的支支原原体体为为解解脲脲支支原原体体临临床床实验室多采用培养法检测。实验室多采用培养法检测。2929六、精浆生化的检测精浆生化的检测 精精浆浆中中的的一一些些生生化化标标志志可可反反映映男男性性附附属属性性腺腺、附附睾睾及及睾睾丸丸生生

13、精精功功能能等等，有有利利于于综综合合评评价价不不育育的的发发病病原原因因和和机制。机制。例例如如，柠柠檬檬酸酸、锌锌、镁镁、谷谷氨氨酰酰转转肽肽酶酶和和酸酸性性磷磷酸酸酶酶可可反反映映前前列列腺腺功功能能，其其中中的的酸酸性性磷磷酸酸酶酶检检测测已已成成为为男男科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法；科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法；果果糖糖与与前前列列腺腺素素可可反反映映精精囊囊腺腺功功能能，常常用用间间苯苯二二酚酚法检测果糖；法检测果糖；游游离离左左旋旋肉肉毒毒碱碱、甘甘油油磷磷酸酸胆胆碱碱和和-葡葡糖糖苷苷酶酶可可反映附睾功能。反映附睾功能。3030精浆总精浆总-葡糖苷酶检测中应注意

14、葡糖苷酶检测中应注意3 3点点离心速度不同，精浆总离心速度不同，精浆总-葡糖苷酶活性有所差异葡糖苷酶活性有所差异 精浆总精浆总-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关关 精浆总精浆总-葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制 3131不同速度离心后的精浆中不同速度离心后的精浆中葡糖苷酶水平葡糖苷酶水平3232禁欲时间对精浆葡糖苷酶的影响Abstinence Abstinence time(day)time(day)n nAlpha-glucosidase(U/ml)Alpha-glucosidase(U/ml)Seminal plasma

15、(1 000 g for 10 min)Seminal plasma(3 000 g for 15 Seminal plasma(1 000 g for 10 min)Seminal plasma(3 000 g for 15 min)min)2 32 3121236.4712.2436.4712.2434.0411.2234.0411.224 54 5161649.6216.8649.6216.86*47.7317.3747.7317.37*6 76 7141451.1419.7651.1419.76*46.7617.7046.7617.70*8 89 968.7014.1068.7014.

16、10*#*#63.8613.6363.8613.63*#*#3333精浆果糖检测中应注意4点：果糖标准液配制后应放置果糖标准液配制后应放置2 2周后使用，而使用周后使用，而使用2 2周周 后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液 离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异精液液化后应立即离心将精子和精浆分离，否则精液液化后应立即离心将精子和精浆分离，否则会影响精浆果糖检测结果会影响精浆果糖检测结果 精浆果糖测定中应引入质量控制体系精浆果糖测定中应引入质量控制体系3434果糖标准液吸光度的监测果糖标准液吸光度的监测3535精液精液

17、 放置时间对果糖浓度的影响放置时间对果糖浓度的影响 GroupnFructose(mmol/L)0 h4815.736.562 h4815.076.56a a4 h4814.736.51b,cb,c3636精浆稀释后放置时间对酸性磷酸酶精浆稀释后放置时间对酸性磷酸酶活性的影响活性的影响 随机选取随机选取随机选取随机选取10101010例精浆，例精浆，例精浆，例精浆，110 000110 000110 000110 000稀释后稀释后稀释后稀释后立即检测立即检测立即检测立即检测ACPACPACPACP活性或活性或活性或活性或稀释后稀释后稀释后稀释后放置放置放置放置30 min30 min30 m

18、in30 min再次检测再次检测再次检测再次检测ACPACP活性，两者比较有活性，两者比较有活性，两者比较有活性，两者比较有极显著极显著极显著极显著性差异性差异性差异性差异（t t t t 3.7703.7703.7703.770，P P P P 0.0010.0010.0010.001）。）。）。）。3737 抑制素抑制素B B被认为是男性精子发生的血清标志物。被认为是男性精子发生的血清标志物。成年男性血清中维持可检测的抑制素成年男性血清中维持可检测的抑制素B B水平需要生精细水平需要生精细胞的存在，唯支持细胞综合征（胞的存在，唯支持细胞综合征（SCOSCO）男性血清抑制素）男性血清抑制素B

19、 B水水平极低。平极低。Brugo-OlmedoBrugo-Olmedo等认为血清抑制素等认为血清抑制素B B在预言非阻塞性无精在预言非阻塞性无精子症病人的睾丸精子存在时比血清子症病人的睾丸精子存在时比血清FSHFSH更准确。更准确。除此之外，抑制素除此之外，抑制素B B还可用于儿童隐睾、性早熟的诊断，还可用于儿童隐睾、性早熟的诊断，监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。目前，抑制素目前，抑制素B B的检测通常使用的检测通常使用双抗体夹心双抗体夹心ELISAELISA法。法。3838七、精浆细胞因子的检测精浆细胞因子的检测 精精浆浆细细胞胞因因子子由由男男性性

20、泌泌尿尿生生殖殖道道内内的的各各种种细细胞胞分分泌泌，包包括括转转化化生生长长因因子子（TGFTGF）、表表皮皮生生长长因因子子（EGFEGF）、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子（TNFTNF）、各各种种白白细细胞胞介介素素（ILIL）及及某某些些可可溶溶性性受受体体等等。目目前前认认为为，与与男男性性不不育育有有关关的的细细胞胞因因子子主主要要有有IL-6IL-6和和IL-8IL-8，不不育育病病人人精精浆中浆中IL-6IL-6和和IL-8IL-8水平明显高于生育力正常的男性。水平明显高于生育力正常的男性。测测定定IL-6IL-6和和IL-8IL-8的的方方法法有有：生生物物学学方方法法、分分子子生

21、生物物学学方方法法和和免免疫疫学学方方法法，以以免免疫疫学学方方法法多多用用，尤尤以以ELISAELISA和和RIARIA常用。常用。3939 八、精子发生相关基因的检测精子发生相关基因的检测 与与精精子子发发生生相相关关的的基基因因很很多多，无无精精子子病病人人的的基基因因缺缺失失均均发发生生于于Y Y染染色色体体的的长长臂臂,主主要要位位于于Yq11.23Yq11.23中中，而而且且并并非非是单一基因，可能含有整个基因大家族。是单一基因，可能含有整个基因大家族。19961996年年，VogtVogt等等人人在在更更大大范范围围对对无无精精子子、少少精精子子病病人人进进行行了了研研究究，认认

22、为为在在3 3个个区区域域均均存存在在AZFAZF，分分别别为为AZFaAZFa，AZFbAZFb，AZFcAZFc，对对这这些些病病人人睾睾丸丸活活检检发发现现，睾睾丸丸的的病病理理改改变与变与AZFAZF的缺失部位有显著相关性的缺失部位有显著相关性。AZFaAZFa：Sy84,Sy86 Sy84,Sy86 AZFb AZFb：Sy124Sy124，Sy127Sy127，Sy132,Sy134Sy132,Sy134 AZFc AZFc：Sy152Sy152，Sy157Sy157，Sy239Sy239，Sy242Sy242，Sy254Sy254，Sy255Sy255 4040AZF检测：SRY

23、存在于基因组中，Yq上的AZFa,b,c 区域的位点全部丢失 病人 正常男性 正常女性 空白对照4141九、遗传学检测遗传学检测 男男性性不不育育的的遗遗传传学学检检测测主主要要是是检检测测精精子子染染色色体体的异常。的异常。常常规规使使用用染染色色体体显显带带技技术术，如如G G带带、Q Q带带等等技技术术，然而其敏感度不及然而其敏感度不及FISHFISH技术技术 FISHFISH技技术术可可用用于于研研究究复复杂杂染染色色体体突突变变如如性性染染色色体体异异常常、未未知知的的小小标标志志物物、环环状状染染色色体体、嵌嵌合合体体及及易位等易位等 Y Y染色体长臂特异区的微缺失与不育相关染色体

24、长臂特异区的微缺失与不育相关 4242病例：46，XX/46,XY异源嵌合体导致真两性畸形腹腔镜检查发现：腹腔镜检查发现：子宫正常大小，发育良好子宫正常大小，发育良好左左右右性性腺腺均均约约4 43 32cm2cm，中中间间均均为为黄黄色色组组织织，两两端端为为白白色色组组织织。未未见见排排卵卵痕痕迹迹。双双侧侧输输卵卵管管发发育育好，均有游离伞端好，均有游离伞端术中探察阴道深度约术中探察阴道深度约7cm.7cm.腹股沟管内未见睾丸及其它男性性器官腹股沟管内未见睾丸及其它男性性器官4343卵睾和输卵管，白色组织为睾丸组织，黄色为卵巢组织4444核型分析：46，XX4545核型分析：46，XY4

25、646外周血淋巴细胞:FISH（X/Y着丝粒探针）：有XX和XY 的细胞4747皮肤成纤维细胞:FISH（X/Y着丝粒探针）：有XX和XY 的细胞4848睾丸成纤维细胞FISH:（X/Y着丝粒探针）：有XX和XY 的细胞4949卵巢成纤维细胞卵巢成纤维细胞:FISHX/Y:FISHX/Y着丝粒探针）：有着丝粒探针）：有XXXY XXXY 的细胞的细胞5050结结 论论 男男男男性性性性不不不不育育育育是是是是最最最最常常常常见见见见的的的的而而而而且且且且可可可可以以以以鉴鉴鉴鉴定定定定的的的的人人人人类类类类生生生生育育育育失失失失败败败败的的的的原原原原因因因因之之之之一一一一。尽尽尽尽管

26、管管管对对对对精精精精子子子子生生生生理理理理学学学学和和和和精精精精子子子子与与与与配配配配子子子子相相相相互互互互作作作作用用用用的的的的生生生生物物物物学学学学过过过过程程程程的的的的研研研研究究究究已已已已取取取取得得得得很很很很大大大大进进进进展展展展，各各各各种种种种各各各各样样样样的的的的检检检检测测测测方方方方法法法法层层层层出出出出不不不不穷穷穷穷，但但但但目目目目前前前前更更更更多多多多的的的的工工工工作作作作应应应应着着着着重重重重于于于于确确确确定定定定那那那那些些些些预预预预言言言言精精精精子子子子特特特特征征征征十十十十分分分分准准准准确确确确、与与与与配配配配子子子子受受受受精精精精能能能能力力力力密密密密切切切切相相相相关关关关的的的的临临临临床床床床男男男男科科科科诊诊诊诊断断断断实实实实验验验验，并并并并应应应应对对对对这这这这些些些些实实实实验验验验的的的的客客客客观观观观性性性性进进进进行行行行评评评评价价价价，这这这这些些些些实实实实验验验验应应应应简简简简便便便便、经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化。5151谢 谢！5252