交泰丸对糖尿病视网膜nf-b表达的影响.docx

《交泰丸对糖尿病视网膜nf-b表达的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《交泰丸对糖尿病视网膜nf-b表达的影响.docx（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、交泰丸对糖尿病视网膜nf-b表达的影响糖尿病性关节炎（ri）是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。这是西方国家最常见的疾 病。据美国眼病流行研究小组估计1.1 饲养饲料及管理200只Wistar二级大鼠，体重165 g195 g,雌雄各半，购自中国医学科学院实验动物 研究所繁育场，许可证编号scxk京2000-0006。喂养饲料购自中国医学科学院实验动物研 究所营养部，许可证编号scxk京2001-0003。饲养条件：室温1825,空气流通，相 对湿度5570%, 12 h光照维持，昼夜循环。每日换笼子或加垫料（锯末）以保持其生活 环境基本干燥。实验期间各组大鼠自由摄食饮水，不给予胰岛素或其他任

2、何降糖药物。1.2 苯磺酸钙胶囊组交泰丸，实验剂型为浸膏，由中国中医科学院广安门医院药剂科制作，批号:20040608, 规格:250mL/瓶，含生药量为1 g/mLo阳性对照药羟苯磺酸钙胶囊（商品名多贝斯）：为毛 细血管循环改善剂，国药准字H20000713,规格:0.5 gX20粒，单位:盒，生产企业:西安 利君制药股份公司。批号:031229。1.3 菌株和仪器STZ,美国Sigma公司产品，购自北京邦定泰克生物技术有限公司。NF-k B一抗为小鼠单 克隆抗体IgGl NF- k B p65 （F-6） :sc-8008。为美国Santa Cruz公司产品，购自北京中 杉金桥生物技术有限

3、公司。胰蛋白酶，1 ： 250,美国DAK0公司产品，购自北京智旋宏达 科技有限责任公司。3%胰蛋白酶消化液（临用时现配）：胰蛋白酶3 g+0.01M PBS （pH=7. 4） 缓冲液100 mLo1. 4 lympusbx-65 光学显微日本OLYMPUS DP-70数码照相装置（1200万像素）。日本OLYMPUS BX-51光学显微镜。美 国Image-Pro Plus 5. 1图像分析软件。稳步倍加型血糖仪SureStepTMPlus BIOOD GLUCOSE METER,美国强生公司 LIFESCAN INC。1.5 造模成功大鼠的分组动物适应性喂养1 W后，将STZ溶于0. I

4、M. pH=4. 6的枸椽酸、枸檬酸钠灭菌缓冲液中， 浓度为2%,按51 mg/Kg体重立即行左下腹腔注射建立DM动物模型，共造模185只。正常 对照组15只仅以等量0. IM, pH=4. 6的枸椽酸、枸椽酸钠缓冲液腹腔注射。1周后，所有 动物禁食8小时以上，断尾取血，测定血糖，将空腹血糖216.7 mmol/L者151只 （6 92毕59）视为DM造模成功大鼠。饲养3月后，将存活的142只DM模型大鼠分层随机 分组，分为五组：即模型组，羟苯磺酸钙组，交泰丸高、中、低剂量组。除正常组始终不 给药以外，造模3月后其余各组开始给药:模型组:用与中药中剂量组等容的蒸储水灌胃； 羟苯磺酸钙组:用相当

5、于临床用药量10倍的羟苯磺酸钙混悬液灌胃；交泰丸高、中、低剂 量组分别用相当于临床用药量20、10、5倍的交泰丸混悬液灌胃。每日给药1次，每月测 1次体重，以调整给药剂量。1.6 视网膜免疫组化nf-b的染色给药3月后随机取42只大鼠进行实验，20%乌拉坦0.5 mL/100 g体重腹内注射麻醉，放 血后立即摘除双眼眼球，固定于10%福尔马林溶液内48 h以上。右眼行视网膜血管消化铺片，清水冲洗多次并浸泡2 h以上，于锯齿缘后0.5 mm处剪开 眼球壁，去除眼前节及玻璃体，余下的眼杯尽量以视乳头为中心，等分成四部分，剥离视 网膜，于0.01M PBS溶液中4过夜，于3%胰蛋白酶溶液内，37,孵

6、育2 h以消化神经 成分，停止消化后，取出视网膜置蒸谓水中漂洗与振荡多次，以使血管外细胞脱落;反复 吹打，仅留一薄层透明的血管网，平铺于洁净的涂胶载玻片上，铺片室温自然干燥;存放4 切片盒。免疫组化NF-kB染色。左侧眼球，于锯齿缘后0.5 nrni处剪开眼球壁，去除眼前节及玻璃体，余下的眼杯进行全 层石蜡包埋，制作4 um切片，并行免疫组化NF-kB染色。眼球壁石蜡切片和视网膜血管消化铺片的免疫组化染色均由OLYMPUS DP-70数码照相装置 （1200万像素）联合OLYMPUS BX-51光学显微镜系统照相，每张切片或铺片均选取5张照 片以Image-Pro Plus 5. 1软件进行计

7、算机图像分析，计算染色的平均光密度值，对NF- k B在视网膜及视网膜血管的表达进行定量分析。眼球壁石蜡切片免疫组化染色步骤:石蜡切片二甲苯I、H脱蜡各15 h,梯度酒精（浓 度分别为100%、100%、95%、95%、90%、80%、70%、50%）至水;自来水浸洗后抗原修复 （置预热3 h的柠檬酸盐缓冲液中，放入微波炉61 3 min）视网膜血管消化铺片NF-kB免疫组化染色步骤:首先自来水浸泡视网膜铺片15 min,其余 步骤同眼球壁石蜡切片免疫组化染色314步。一抗浓度为1： 50。DAB溶液显色时间为 10 mino1. 7选择反渗透膜的方法,把两两比较作为ws-n-k法、s-n-k

8、法、s- n-k法比较使用SPSS 14.0统计软件进行。行单因素方差分析(one-way analysis of variance, One-Way ANOVA),两两比较采用Student Newman Keuls (S-N-K)法，方差不齐性时，两 两比较采用Games-Howell法。22. 1神经节细胞nf-b的表达NF-kB在正常组主要表达于视网膜神经节细胞、血管内皮细胞的细胞质，表达较弱。模型 组NF-kB被激活，主要表达于视网膜神经节细胞、血管内皮细胞、内核层及外核层的细 胞核。各组大鼠的阴性对照片未见阳性反应发生。2.2内皮细胞染色正常组和模型组表达的部位皆为周细胞而不是内皮

9、细胞(图7图12) o模型组染色深而 反应强，正常组不染色或染色浅，反应弱。各组大鼠的阴性对照片未见阳性反应发生。3. nf-b二聚体NF-kB是一种以可诱导形式广泛存在的蛋白质，在静息状态下，NF-k B的p50/p65亚基 与其特异性抑制物IB结合形成三聚体，覆盖着p50亚基的核定位序列(nuclear localization sequence, NLS),使NF-k B以非活化的形式滞留在胞浆中。当细胞受到 活化刺激，如炎症、晚期糖化终未产物(advanced glycosylation end products, AGEs)、氧化应激等，NF-kB二聚体从NF-kB-IB三聚体中释放出来，暴露了 p50亚基的 NLS,进入活化状态，移位到细胞核内，发挥调控细胞功能的作用。NF-k B作为一个具有多向性调节作用的核转录因子，由于对众多调节血管病变的细胞因子、 黏附分子等均有调控作用，而被视为DM微血管病变的中心调节因子因此NF-kB的激活被认为在DM血管并发症中起重要作用。NF-kB可能是DR发生、发展 的一个关键因素，通过抑制NF-kB活化的各个环节，可能是预防和治疗DR的重要的研究 方向。我们的实验中，无论是眼球切片还是视网膜血管消化铺片，均可见模型组大鼠视网 膜NF-k B免疫组化染色较正常组明显增强，此结果与文献