PCR荧光检测试剂盒生产质控作业规程.doc

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1、 PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程一. 微量加样器使用规定 1微量加样器校正：使用微量加样器吸10l 10次与否为100l。 2加样前吸头润湿： 当吸头排空时，仍会有某些残留液体以薄膜形式吸附在吸头里面，因此，在加样时先吸打液体多次，充分润湿吸头管腔,以保证加样一致性。 3加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头液体顺着管壁流出，防止液滴形成由于其表面张力作用而制止样本释放。 4吸头与否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。5加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一停点，缓慢慢慢吸入液体。停留1s，然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸嘴外面也许黏附液滴。放液时通过第一

2、停点，停1-2s后，继续按压到第二停点，排出残存液体。 6PCR反映原液由于有甘油在冷状态较黏稠,易于1次吸取数人份，慢某些。 7边加边看,直观预计,防止跳管。 8低温冷藏批量DNA提取液、PCR反映液A和B取出时与否充分混匀后,分装使用，PCR反映液A和B与否避光低温冷藏和使用。9配PCR反映液应先加缓冲液再加PCR反映液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。 10PCR反映液（涉及样品）应充分混匀:保证PCR反映曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。二PCR实验操作规程程序操作检查操作1混匀办法每一次提示注意倒置混匀、移液器吹打、震荡，50000rpm离心1分钟。2取血

3、清样本1）因水分蒸发变浓2）冻状、混浊按（1）法混匀,再取25l加水5l混匀。温水浴37溶解按（1）法混匀,或1rpm离心5分钟，取清液。3取质控品冻状、混浊温水浴37溶解按（1）法混匀或1rpm离心5分钟，取清液。4血清样本稀释混匀血清阴性血清40l加阳性血清10l，按（1）法混匀。5倍稀释5质控品稀释混匀质控品血清稀释液40l加质控品10l，按（1）法混匀5倍稀释。6血清样本DNA提取DNA提取液完好血清样本按（1）法混匀，取30l加DNA提取液60l，按（1）法混匀，98 8分钟变性，0冷却2-3分钟，1rpm，离心10分钟,吸取上清液。7质控品DNA变性分装，有效，呈清液状态，未重复加

4、热、冻融质控品按（1）法混匀，取30l5000rpm离心1分钟，98 5分钟变性,5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。8PCR反映液混匀状态取25l反映液加5l提取DNA，按（1）法混匀，5000rpm离心1分钟， 5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。9PCR反映室温10-30PCR反映槽四角不放管。10设阴性对照阴性混匀血清CT3811阳性参照品各浓度呈梯度以PCRA反映液制作原则曲线，呈直线。12阴性质控品B各浓度呈梯度以PCRA和B反映液制作原则曲线，呈直线。*血清稀释液：全阴性血清再加2倍HBV DNA提取液混匀，5000rpm，离心1分钟，混匀血清98 5分钟变性,1rpm，

5、离心10分钟,吸取上清液。三.超净工作台使用、维护保养与清洁原则操作规程 1.目 建立一种超净工作台使用、维护保养与清洁原则操作程序，使操作过程原则化。 2.职责 质量部QC负责本文献起草，质量部及QC检查人员负责本原则实行。 3.范畴 本原则合用于超净工作台使用、维护和保养与清洁。 4.内容 4.1超净工作台重要构成某些：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道某些。 4.2安放点选取： 4.2.1应安放于卫生条件较好地方，便于清洁，门窗可以密封以避免外界污染空气对室内影响。 4.2.2安放位置应远离有震动及噪音大地方。 4.2.3禁止安放在产生大尘粒及气流大地方，以保证操作区空气

6、正常流动。 4.3使用前检查： 4.3.1接通超净工作台电源。 4.3.2旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出风面与否有风送出。 4.3.3检查照明及紫外设备能否正常运营，如不能正常运营则告知工程部检修。 4.3.4工作前必要对工作台周边环境及空气进行超净解决，认真进行清洁工作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌解决。 4.3.5净化工作区内禁止存储不必要物品，以保持干净气流流动不受干扰。 4.4使用： 4.4.1使用工作台时，先通过清洁液浸泡纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。 4.4.2接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，解决净化工作区内工作台表面积累微生物，30分钟后，

7、关闭紫外灯，启动送风机。 4.4.3工作台面上，不要存储不必要物品，以保持工作区内干净气流不受干扰。 4.4.4操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。 4.4.5最后启动工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 4.4.6每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术原则，应调节调压器手柄，变化风机输入电压，使工作台处在最佳状况。 4.4.7每月进行一次维护检查，并填写维护记录。 4.5清洁 4.5.1每次使用完毕，及时清洁仪器，悬挂标记，并填写仪器使用记录。 4.5.2取样结束后，先用毛刷刷去干净工作区杂物和浮尘。 4.

8、5.3用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干。 4.5.4要经惯用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力. 4.5.5效果评价:设备内外表面应当光亮整洁，没有污迹。 四.检查办法操作规范1.混匀：反映液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后5000 rpm离心数秒(按原阐明进行)。2.精确：反映液及样本混匀后,每一步加样精确(按原阐明进行)。3.新鲜血清样本： 血清样本混匀后离心（5000 rpm离心数秒），取30l，加2倍量DNA提取液60l混匀100 8-9分钟变性，放置冰箱0冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀

9、，再取5l加样。4. 长期放置冰箱冷藏血清样本：取25l，加无菌水5l加2倍量DNA提取液60l混匀98 8-9分钟变性，放置冰箱0冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀，再取5l加样.5. DNA提取液解决并冷藏保存血清样本：DNA提取液解决：血清样本混匀，取200l，加DNA提取液400l混匀98 5分钟变性，放置冰箱0冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100l /管分装冷藏保存.保存血清样本使用：取1管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀，5000 rpm离心数秒，再取30-40l 98 5-6分钟变性，放置冰箱0冷却2-3分

10、钟，5000 rpm离心数秒，再取5l加样.6.质粒DNA关于质控品（P和N）：用全阴性血清与质粒DNA按9:1混匀，5000rpm，离心1分钟,再加2倍HBV DNA提取液混匀，5000rpm，离心1分钟，混匀血清98 5分钟变性,1rpm，离心10分钟,吸取上清液，取出所有上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100l /管分装冷藏保存.关于质控品使用：取1管分装冷藏保存质控品，融化后混匀，5000 rpm离心数秒，再取30-40l 98 5-6分钟变性，放置冰箱0冷却2-3分钟，5000 rpm离心数秒，再取5l加样.五.防止荧光定量PCR产物污染质控规程1.目规范荧光定量PCR实验和生产操作

11、过程，保证操作过程中无PCR产物污染。2.合用范畴本规范合用于荧光定量PCR实验和生产操作过程。该规程参照中华人民共和国艾滋病核酸检测技术规范。3.职责划分操作人员按照此原则操作规范进行荧光定量PCR实验和生产，质检部经理负责监督。4.质量保证体系4.1实验室和生产工作区质控体系4.1.1实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备区(GMP车间超净工作室)、样品解决区（质检室1）、扩增区（质检室2）和扩增产物分析区（质检室3）。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区功能是：(1)样品解决区：样品登记、分装。各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提取、保存和加样。（2)试剂准备区：

12、PCR扩增试剂配制、分装和保存。(3)扩增区：普通PCR扩增及荧光定量PCR扩增。 (4)扩增产物分析区：PCR扩增产物电泳、杂交、成像、测定、成果分析、报告。4.1.2用有效办法对操作区域和共用器具在实验先后进行清洁及消毒推荐程序是：a. 实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除。b. 移入盛放污染材料器皿、所需试剂、耗材和样品，进行实验。c. 一种实验区域在同一时间段只进行一种实验。d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸

13、巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。4.1.3实验工作区内必要穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根据规定戴不同规格手套。4.1.4 PCR产物分析使用相对封闭系统或共用分析软件时，如特定凝胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件，每位实验人员都要精确命名自己设立程序及分析成果，使用完毕后需收拾好所用仪器并保存好自己实验分析成果。4.1.5 各区域仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。 4.2 荧光定量PCR扩增实验过程控制体系：4.2.1样品采集和解决4.2.1.1用于普通PCR或荧光定量PCR检测样品有细胞、全血、血浆、各种组织和其她分泌物，有时还涉及生物制

14、品。4.2.1.2采集样品应避免微生物和核酸污染（所用器皿必要无菌或属于一次性用品，RNA类样品所用器皿必要没有RNA酶污染）。4.2.1.3解决样品应在样品解决区由专人进行。解决和保存用于抽提DNA或RNA样品应避免DNA或RNA酶导致降解，普通规定在采样后1小时内解决并低温保存。4.2.1.4解决后样品应分装、标记（需用防水笔填写），并做好实验记录，冻存于-20如下，DNA或RNA类样品应冻存于-60或保存在液氮中。4.2.2核酸（RNA/DNA）提取4.2.2.1应在规定区域内由专人按相应程序进行。4.2.2.2应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应通过消毒解决并一次性使用。4.2.2

15、.3提取RNA时应避免RNA酶污染，抽提RNA样品实验使用移液器及离心管等用品必要用DEPC解决，去除RNA酶。4.2.2.4 配制RNA逆转录或DNA反映试剂，所有操作超过10分钟时应将反映管置于冰盒内，防止各种酶及样品DNA或RNA降解。4.2.3.3进行逆转录反映时应避免RNA酶污染，实验使用移液器及离心管等用品必要用DEPC解决，去除RNA酶。4.2.3.4扩增仪应预热，时间不少于20分钟。4.2.3.5 进行内参基因扩增（actin或GAPDH），并设立递增PCR循环数，电泳拟定逆转录效率及CDNA样品起始浓度，为荧光定量PCR实验做准备，成功逆转录样品在PCR扩增时25个循环即可见

16、清晰内参条带。4.2.4荧光定量PCR实验：4.2.4.1应在样品解决区内加样。迅速精确将样品DNA或RNA小心加入装有反映液体反映管内，盖紧盖子并做好标记。4.2.4.2操作超过10分钟时应将反映管置于冰盒内，防止酶降解及副反映发生。4.2.4.3严格按照荧光定量PCR仪操作手册启动机器，设立实验扩增程序，保存文献，最佳以日期及样品名称命。PCR扩增仪应预热，时间不少于20分钟。4.2.4.5将反映管置于扩增仪上，开始扩增。4.2.4.6反映结束时停止实验程序，取出反映产物，20保存。4.2.4.7扩增成果分析和定量按照操作手册进行，对三孔平行实验成果必要一方面判断其与否精确（孔间差别0.3

17、时应考虑舍弃该孔数据，并重新进行该样品荧光定量PCR实验），然后依照原则曲线计算出各样品浓度。4.2.7.8成果报告中应注明使用实验办法、实验试剂、实验仪器及样品种类和样品量。4.3 客户沟通质量体系：4.3.1收到样品后，由专业负责人进行样品清点和整顿工作，以保证样品数目精确性和样品有效性。如有问题，应及时与客户进行沟通。4.3.2在保证样品无误和有效状况下，由专业技术人员进行样品解决工作核酸抽提工作（按照原则操作）；并进行抽提DNA或RNA浓度测定。在此环节实验结束后，将成果整顿，并及时发送给客户。如有问题浮现，则和客户及时沟通，保证明验下一步工作。4.3.3在保证核酸抽提对的和有效前提下

18、，进行逆转录实验过程（按照原则操作进行）。实验结束后，将成果整顿，并及时发送给客户。如有问题浮现，则和客户及时沟通，保证明验下一步工作。4.3.4在保证逆转录对的和有效前提下，进行样品预实验过程。摸索检测基因反映条件，并将成果及时告知客户。4.3.5在预实验成功前提下，进行正式荧光定量PCR实验。实验开始后，每周和客户进行一次沟通（可以通过电话或e-mail及网络方式），报告实验进展状况，并认真记录客户提出建议和意见，对浮现问题随时协商解决。六试剂盒生产和制备 1试剂盒生产和制备地点 在GMP净化车间进行，净化车间内工作人员应穿着符合规定工作服和帽子。选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气干净

19、度级别规定相适应，并不得混用。2工艺用水 制水设备应满足水质规定并通过验证，经灭菌解决。3微量加样器 使用先后用灭菌消毒纸包好，置传递窗，紫外线消除DNA30分钟。4生产区域定期清洁、清洗和消毒 生产区域定期清洁、清洗和消毒，高风险生物活性物料其操作应使用单独空气净化系统，与相邻区域保持负压，排出空气不能循环使用。5 质粒DNA制备和提纯 在质粒DNA制备和提纯过程中,所有器具都应灭菌消毒，紫外线照射，保证无质粒DNA和PCR产物污染。质粒DNA制备和提纯后，及时分装，置放于用高压解决容器中，60保存，防止质粒DNA扩散和被PCR产物汽溶胶污染。6 病毒(HBV)核酸定量原则品、阴性参照品、阳

20、性参照品，质粒DNA和PCR产物污染防止 将原则品和参照品包装表面清除质粒DNA和PCR产物污染后，在超净工作条件下，分装，置放于用高压灭菌解决容器中，60保存，防止质粒DNA扩散和被PCR产物汽溶胶污染。7 PCR反映管中PCR反映产物污染消除应用尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）对DNA中dUTP酶解作用酶PCR反映产物DNA.将UNG酶100 u单位浓度稀液稀释到0.5u/l ,每支PCR反映管中加入0.2l,进行UNG酶解,消除污染。含dUTP10mM dNTP配制:原材料：dATP 100mM /250 l；dGTP 100mM /250 l；dCTP 100mM /250 l；dTA

21、TP 100mM /250 l;dUTP 100mM /250 l。配制10mM dNTP:dATP 100mM /20 l；dGTP 100mM /20 l;dCTP 100mM /20 l；dTTP 100mM /10 l;dUTP 100mM /10 l；共计25 mM /80 l ,稀释2.5倍-10 mM /200 l。PCR循环条件按如下设立：37 5分钟UNG酶解反映，93 3分钟预变性，然后93 30秒-55 30秒循环10次，93 30秒-55 60秒循环30次。37 5分钟UNG酶解反映,使PCR反映产物污染完全消除。七.质量监控点：工序质量控制点质量控制项目频次生产前原辅

22、料由指定供应商提供批批检查符合质量原则每一进厂批次内包装材料外包装材料纯化水符合质量原则1次/周校准原辅料符合配制规定配制物料品种、数量1次/批投料计量设备通过校验,在有效期内双人复核称量克隆菌种保存与纯化纯化菌种菌种复壮、纯化、防污染1次/2月阳性原则品制备质粒制备纯度、浓度1次/批阳性原则品制备配制、分装、低温保存阴性质控品制备血清蛋白制备无HBV、配制、分装、低温保存1次/批PCR反映液制备防污染、移液器精准加量、配制、分装、低温保存随时/班包装包材数量、无破损、色泽统一随时/班批号对的、清晰成品数量精确、包装码放符合规定试剂盒保存低温干净防止重复冻融，浮现菌斑随时/班八.生物安全准则本

23、原则旨在规范临床实验室安全管理，内容着重在实验室和工作人员安全普通规定，防火、用电、化学危险物品、微生物安全规定，以保证明验室安全运作，将事故控制在最低限度。为各级临床实验室安全管理提供根据。1.工作人员和实验室安全普通规定1.1实验室工作区内绝对禁止吸烟。1.2实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手口”接触也许其他物质。实验室工作区内冰箱禁止存储食物。1.3实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆。1.4解决腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其他保护眼睛和面部防护用品。工作人员在实验室危险区内不要佩戴隐形眼镜，除非同步使用护目镜或面罩。使用、解决可以通过粘膜和皮肤感染试剂，或有也许发生试剂溅

24、溢状况时，必要佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。1.5实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者先后、以及在进食或吸烟前都应当洗手。接触血液、体液或其他污染物时，应及时洗手。1.6外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”和“非清洁”个人防护服要分开存储。1.7实验室出口和通道必要保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必要保持畅通，不得堵塞。防火门前不能堆物，以保证失火时可以自动关闭。2.实验室用电安全准则2.1作为仪器维护办法一某些，应进行年度安全用电检查并

25、建立档案记录。实验室应装有足够插座，分布要合理，以减少在插座上接上其他多用插座和避免拖拉过多电线。2.2所有电器设备维修与维护只能由获得正式资格维修人员进行。3.实验室微生物安全准则在临床实验室，工作人员在接触标本和操作过程中，也许被感染。临床实验室也许接触微生物可分为三类：病毒、细菌、其她具备高毒力病原体，如出血热病毒和立克次体。由于从病史和体检不能可靠地鉴定所有病人病原体，因此当接触和解决所有体液时，均应执行“常规防止办法”。3.1所有单位都应执行“常规防止办法”。此外，每个实验室都应拟定每个职工工作岗位潜接触限度。一旦拟定有接触潜在感染原也许，应采用硬件控制和操作过程控制，以减少或消除接

26、触这些潜在感染原也许。各单位应提供相应个人防护装备，如手套、工作服、实验服、面罩、面具、护目镜、安全镜和鞋套等。并解说何时使用和如何使用。3.2来自所有病人血液和体液都被以为是具备传染性。所有血液和体液标本都应放置于具备安全盖构造优良容器里，以防在运送过程中发生泄漏。采集标本时应防止污染容器外表或随标本检查单。如果存在潜在或实际污染，则应再加一层包装（例如：包装袋）。所有标本应加上生物危害标签。所有解决血液和体液（例如：取下真空试管塞子）工作人员都应戴上手套。如果有也许发生血液或体液喷溅，则应使用面部防护装备。3.3血液或其她体液发生泄漏或工作结束后及，均应使用适当化学杀菌剂对实验室工作区进行

27、表面消毒。可使用新鲜配制漂白粉溶液（次氯酸钠1:10稀释液）和2.5甲酚溶液或其他有效溶液对所有工作台进行消毒。漂白剂溶液应至少作用15分钟，使用其他消毒剂可参照其产品阐明书。3.4手或其她部位皮肤接触血液或其她体液后必要及时彻底清洗。在实验工作结束后或取下手套后应及时洗手。在离开实验室之前应脱下所有个人防护装备。3.5必要采用通用警告标志系统明确标记装有危险生物制品容器或被其污染物品，在危险废弃物容器、存储血液和其他有潜在传染性物品冰箱、以及解决尖锐物品容器上，所贴标签应标明通用生物危害标志。3.6生物安全橱是微生物实验室里控制生物危害最佳方式之一。实验室应制定安全橱维护规程，以保证安全橱内适当气流流速，并适时更换滤器。安全橱放置应远离气流不稳定地方，通风口设立应依照产品阐明书。在维护、移动和使用或解决安全橱之前必要对生物安全橱进行消毒。