第四章-植物器官培养.ppt

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1、第四章第四章 植物器官培养技术植物器官培养技术1 植物器官培养（植物器官培养（Organ CultureOrgan Culture）是指离体条）是指离体条件下对植物体的不同器官进行培养，并再生植株件下对植物体的不同器官进行培养，并再生植株的过程，主要包括离体的过程，主要包括离体根、茎、叶、果实、种子、根、茎、叶、果实、种子、花器官花器官的培养。的培养。其中离体其中离体茎的培养茎的培养（包括茎尖、茎段及节间）（包括茎尖、茎段及节间）和和叶片培养叶片培养（包括叶片和叶柄）应用的较为广泛。（包括叶片和叶柄）应用的较为广泛。一、植物器官培养及类型一、植物器官培养及类型2外植体外植体愈伤组织愈伤组织脱分

2、化脱分化再分化再分化体细胞胚体细胞胚器官发生器官发生植株植株植株植株单极器官单极器官两极性两极性图图1 外植体形态发生形成完整植株的途径外植体形态发生形成完整植株的途径3 茎尖培养茎尖培养（shoot tip culture）是指对植物顶是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。茎尖培养茎尖培养包括广义和狭义两个方面，狭义上指包括广义和狭义两个方面，狭义上指小到小到10100 m的茎尖分生组织，广义上指大到的茎尖分生组织，广义上指大到几十几十mm 的茎尖或更大的芽。一般材料体积小或的茎尖或更大的芽。一般材料体积小或不带叶原基的茎尖分生组织培养越

3、困难，成苗所不带叶原基的茎尖分生组织培养越困难，成苗所需时间较长，而培养材料体积大越，成苗速度越需时间较长，而培养材料体积大越，成苗速度越快。快。二、植物茎尖组织培养二、植物茎尖组织培养4 茎尖培养在植物组织培养中广泛应用，主要茎尖培养在植物组织培养中广泛应用，主要用于用于种苗快速繁殖种苗快速繁殖，进行脱毒苗的生产进行脱毒苗的生产，品种，品种改良和基础理论研究。改良和基础理论研究。如在如在蝴蝶兰、非洲菊、凤梨等花卉种苗蝴蝶兰、非洲菊、凤梨等花卉种苗的种的种苗快速繁殖以及苗快速繁殖以及草莓、香蕉、马铃薯等草莓、香蕉、马铃薯等脱毒种脱毒种苗的生产中广泛应用。苗的生产中广泛应用。5 图图2 植物茎尖

4、培养过程植物茎尖培养过程6 图图3 植物茎尖分生组织培养植物茎尖分生组织培养7 1、起始培养阶段、起始培养阶段（Initiation）2、增殖培养阶段、增殖培养阶段（Multiplication）3、生根培养阶段、生根培养阶段（Rooting）4、驯化移栽阶段、驯化移栽阶段（Acclimatization）茎尖培养的阶段划分茎尖培养的阶段划分8 起始培养阶段为无起始培养阶段为无菌体系的诱导和建立过菌体系的诱导和建立过程。主要受程。主要受外植体、培外植体、培养基以及环境条件养基以及环境条件等的等的影响。影响。（一）外植体（一）外植体（explant）的起始培养）的起始培养 图图4 无菌系的建立无

5、菌系的建立9 图图5 蝴蝶兰花梗腋芽的切割和接种蝴蝶兰花梗腋芽的切割和接种10 A、选取适宜的基因型（品种）；、选取适宜的基因型（品种）；B、选取适宜的茎尖外植体；、选取适宜的茎尖外植体；C、流水冲洗外植体；、流水冲洗外植体；D、外植体切割、分离及灭菌处理；、外植体切割、分离及灭菌处理；75乙醇和乙醇和0.1%的的HgCl2。E、外植体接种于诱导培养基；、外植体接种于诱导培养基；添加细胞分裂素。添加细胞分裂素。F、环境条件控制促进外植体的生长。环境条件控制促进外植体的生长。1、起始培养的一般过程：、起始培养的一般过程：11灭菌时间灭菌时间使使 用用 浓浓度（）度（）持续时间持续时间（min）去

6、除难易程度去除难易程度效果效果次氯酸钙次氯酸钙9-105-30易易很好很好次氯酸钠次氯酸钠25-30易易很好很好过氧化氢（双氧水）过氧化氢（双氧水）10-125-15最易最易好好溴水溴水1-22-10易易很好很好硝酸银硝酸银15-30较难较难好好氯化汞氯化汞0.1-12-15较难较难最好最好抗菌素抗菌素4-50ppm30-60中中比较好比较好 表表1 常用表面灭菌剂使用浓度及灭菌效果常用表面灭菌剂使用浓度及灭菌效果12 A 细胞分裂的启动；细胞分裂的启动；B 细胞增殖；细胞增殖；C 组织和器官的形成。组织和器官的形成。2、接种茎尖外植体的生长过程、接种茎尖外植体的生长过程13 A 腋芽萌发进行

7、增殖；腋芽萌发进行增殖；B 脱分化形成不定器官；脱分化形成不定器官；C 脱分化形成形成胚状体；脱分化形成形成胚状体；D 脱分化形成愈伤组织。脱分化形成愈伤组织。3、离体茎尖的发育方向、离体茎尖的发育方向14 （1 1）外植体因素：外植体因素：遗传基础及生理影响遗传基础及生理影响 （2 2）培养基组成：培养基组成：矿物盐类、微量有机矿物盐类、微量有机成分、成分、生长调节物质生长调节物质、碳源、琼脂、活性炭、碳源、琼脂、活性炭、酚类化合物、多胺等。酚类化合物、多胺等。（3 3）培养条件：培养条件：光照、温度、湿度光照、温度、湿度 4、影响茎尖外植体起始培养的因素、影响茎尖外植体起始培养的因素15（

8、1）外植体）外植体 外植体种类及基因型外植体种类及基因型 外植体供体植株和外植体的生理状态外植体供体植株和外植体的生理状态 外植体大小外植体大小 外植体的极性外植体的极性16a.单子叶植物不易诱导器官发生。单子叶植物不易诱导器官发生。b.木本植物较难诱导。木本植物较难诱导。c.存在基因型差异（如番茄存在基因型差异（如番茄29%63%）d.开始生长季节取材容易诱导。开始生长季节取材容易诱导。17外植体大小：外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增殖较快。殖较快。外植体极性：外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于培养基上时，当外植体以形态学的基部接

9、种于培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。18 图图6 茎尖分生组织示意图茎尖分生组织示意图virus-virus-freefreetissuetissue19（2）培养基）培养基 A 培养基类型培养基类型:MS、B5、White B 碳碳 源的影响源的影响:蔗糖、葡萄糖等蔗糖、葡萄糖等 C.植物生长调节物质植物生长调节物质 细胞分裂素、生长素类、赤霉素类及其他细胞分裂素、生长素类、赤霉素类及其他20a.部分植物单独使用细胞分裂素（部分植物单独使用细胞分裂素（CTK）可以形）可以形成成 无根苗无根苗b.部分植物无根苗的形成需要细胞分裂素和生长部

10、分植物无根苗的形成需要细胞分裂素和生长素配合使用。素配合使用。c.外源外源CTK与生长素必须维持适当比例以改变与生长素必须维持适当比例以改变内源激素平衡，促进器官发生。内源激素平衡，促进器官发生。d.不同细胞分裂素对分化的作用效果不同。不同细胞分裂素对分化的作用效果不同。21 赤霉素类赤霉素类 赤霉素与促进细胞伸长和开花反应，组织培赤霉素与促进细胞伸长和开花反应，组织培养条件下只在少数植物上对芽的诱导有促进作养条件下只在少数植物上对芽的诱导有促进作用。用。如马铃薯、甜菜、樱桃等。如马铃薯、甜菜、樱桃等。22其他有机化合物：其他有机化合物：腺嘌呤衍生物具有促进器官分化作用。腺嘌呤衍生物具有促进器

11、官分化作用。椰子汁等物质也具有促进分化的功能。椰子汁等物质也具有促进分化的功能。23A 光照光照 通常通常10005000 Lx 16 小时光照。小时光照。非洲菊非洲菊1000 lx，洋葱，洋葱 16小时，马铃薯连续小时，马铃薯连续光照，葡萄要求短日照。光照，葡萄要求短日照。光质也影响芽的再生，光质也影响芽的再生，蓝光有利于芽器官蓝光有利于芽器官发生发生，烟草实验，而，烟草实验，而红光有利于根红光有利于根的发生。的发生。（3）培养条件及其他因素培养条件及其他因素24B 温度温度 大部分植物要求大部分植物要求25 oC，少数要求较低温度，少数要求较低温度（15 20 oC）或较高的温度（）或较高

12、的温度（30 oC）如菖蒲、水仙、洋葱、龟背竹等。如菖蒲、水仙、洋葱、龟背竹等。变温处理变温处理对有些植物器官发生有促进作用，对有些植物器官发生有促进作用，如豌豆。如豌豆。25 C、培养基其他因素：培养基其他因素：如活性炭（如活性炭（Activated Charcoal）、酚类物）、酚类物质（质（Phenolic compounds）、）、pH值、继代培养值、继代培养次数（次数（subculture）、渗透压等。）、渗透压等。26（二）无菌苗的增殖（二）无菌苗的增殖 1、增殖培养过程：、增殖培养过程：增殖培养过程是促增殖培养过程是促进无菌苗数量增加的进无菌苗数量增加的过程。主要通过芽增过程。主

13、要通过芽增殖芽的过程进行。殖芽的过程进行。27 图图6 蝴蝶兰无菌苗的增殖培养蝴蝶兰无菌苗的增殖培养28图图7 7 玉簪无菌苗增殖培养玉簪无菌苗增殖培养29 （1 1）细胞分裂细胞分裂素素浓度直接影响增殖的效果，浓度直接影响增殖的效果，通常使用浓度低于起始培养阶段。通常使用浓度低于起始培养阶段。高浓度细胞分裂素会导致植株高浓度细胞分裂素会导致植株玻璃化玻璃化（Vitrification）等现象的发生，过低的浓度会等现象的发生，过低的浓度会影响增殖速率，因此应选择适宜的浓度。影响增殖速率，因此应选择适宜的浓度。（2）添加少量的生长素添加少量的生长素，如，如NAA或或IAA有利有利于维持无菌苗适宜

14、的激素平衡，促进增殖。于维持无菌苗适宜的激素平衡，促进增殖。2 2、影响增殖的因素、影响增殖的因素30（3 3）增殖阶段要给予外植体适宜的温度和光）增殖阶段要给予外植体适宜的温度和光照条件，才能保证其旺盛的增殖过程。照条件，才能保证其旺盛的增殖过程。（4 4）增殖培养阶段要注意及时转接，否则生）增殖培养阶段要注意及时转接，否则生长变弱。长变弱。31图图8 蝴蝶兰和冬青的无菌苗增殖生长状态蝴蝶兰和冬青的无菌苗增殖生长状态32（1 1）小型化和无效苗）小型化和无效苗 激素浓度过高激素浓度过高导致无效苗增加。可以通导致无效苗增加。可以通过降低细胞分裂素浓度克服。过降低细胞分裂素浓度克服。（2 2）玻

15、璃化现象）玻璃化现象 琼脂用量低琼脂用量低，相对湿度大，相对湿度大，激素浓度高激素浓度高，温度高等温度高等导致玻璃化。导致玻璃化。3 3、增殖培养中的常见问题、增殖培养中的常见问题33（3 3）变异问题）变异问题 继代次数过多继代次数过多或由愈伤组织途径形成的或由愈伤组织途径形成的无菌苗的连续增殖；激素条件不适宜等易导无菌苗的连续增殖；激素条件不适宜等易导致变异。致变异。（4 4）污染问题）污染问题 转接前未将污染材料分出造成转接前未将污染材料分出造成交叉污染交叉污染；培养环境无菌程度低。培养环境无菌程度低。34 增殖培养阶段形成的无根苗在适当的条件增殖培养阶段形成的无根苗在适当的条件下诱导形

16、成不定根的过程下诱导形成不定根的过程.（三）生根培养阶段（三）生根培养阶段(Rooting)35（1）矿质营养：）矿质营养：76%的植物可以在的植物可以在MS,1/2MS,1/3MS培养基培养基上正常生根。低盐有利于生根上正常生根。低盐有利于生根（White,Knop），提高提高Ca浓度有促进作用。浓度有促进作用。（2）碳源的影响）碳源的影响 多数植物在多数植物在2030gL-1蔗糖蔗糖有利于生根。有利于生根。无蔗糖生根减少，浓度影响根重。无蔗糖生根减少，浓度影响根重。1、培养基成分对不定根形成的影响、培养基成分对不定根形成的影响36A.生长素类：通常为生根必需；生长素类：通常为生根必需；IB

17、A、NAA等等（3）植物激素及生长调节物质植物激素及生长调节物质 B.细胞分裂素：细胞分裂素：通常有抑制作用；通常有抑制作用；C.ABA 和和 GA：ABA/GA3高比值促进生根。高比值促进生根。37 图图9 不同生长素对番茄生根的影响不同生长素对番茄生根的影响38 图图10 不同不同IBA浓度对番茄生根的影响浓度对番茄生根的影响39（1）温度：）温度：21-30 oC 对多数植物有利。对多数植物有利。（2）光照因素）光照因素:黑暗条件利于生根。黑暗条件利于生根。2、培养条件及其他因素的影响、培养条件及其他因素的影响401 1、透气锻炼：、透气锻炼：逐渐打开瓶口，增加适应性，逐渐打开瓶口，增加

18、适应性，3 37 7天。天。2 2、洗去培养基：、洗去培养基：生根苗培养基中由于带有蔗糖而易滋生细菌和生根苗培养基中由于带有蔗糖而易滋生细菌和真菌。真菌。（四）生根苗的驯化移栽（四）生根苗的驯化移栽413 3、选择适宜的驯化基质：、选择适宜的驯化基质：透气保水性要好。透气保水性要好。蛭石、泥炭、珍珠岩蛭石、泥炭、珍珠岩等。等。4 4、无菌苗移栽：、无菌苗移栽：驯化锻炼的无菌苗栽植于基质中。水分要浇足，注驯化锻炼的无菌苗栽植于基质中。水分要浇足，注意保湿，也要注意透气。意保湿，也要注意透气。42 温度：温度：低温季节提高根部温度。促进新根形成；高低温季节提高根部温度。促进新根形成；高温季节注意降

19、温。温季节注意降温。湿度：湿度：成活前均要注意保湿，防治水分蒸腾。可以成活前均要注意保湿，防治水分蒸腾。可以采取喷雾加湿。采取喷雾加湿。光照：光照：前期适当遮荫，保持弱光条件，成活后逐渐前期适当遮荫，保持弱光条件，成活后逐渐加强。加强。水分：水分：移栽时浇足水，以后适当控制，不干不浇。移栽时浇足水，以后适当控制，不干不浇。营养：营养：组培苗新根形成前不施肥，成活后补充营养，组培苗新根形成前不施肥，成活后补充营养，采用营养液或复合肥等。采用营养液或复合肥等。5 5、移栽后的环境条件控制：、移栽后的环境条件控制：43 图图11 组培苗驯化移栽组培苗驯化移栽44图图12 利用驯化装置进行无菌苗驯化利

20、用驯化装置进行无菌苗驯化45图图13 玉簪无菌苗移栽和生长状况玉簪无菌苗移栽和生长状况46 图图14 凤梨组培苗工厂化生产凤梨组培苗工厂化生产47 对离体的叶片外植体进行培养，并再生出对离体的叶片外植体进行培养，并再生出完整植株的过程。完整植株的过程。培养过程主要包括：培养过程主要包括：愈伤组织诱导；不定愈伤组织诱导；不定芽分化；无菌苗增殖及生根等芽分化；无菌苗增殖及生根等。三、叶片离体培养：三、叶片离体培养：48 图图15 叶片离体培养过程叶片离体培养过程49 图图16 花烛叶片离体培养及植株再生花烛叶片离体培养及植株再生50 诱导接种的叶片外植体脱分化形成愈伤组诱导接种的叶片外植体脱分化形

21、成愈伤组织的过程。愈伤组织的形成通常经历织的过程。愈伤组织的形成通常经历诱导期、诱导期、分裂期和分化期分裂期和分化期等阶段。等阶段。生长素及细胞分裂素生长素及细胞分裂素对愈伤组织的形成具对愈伤组织的形成具有促进作用。有促进作用。高浓度生长素及适当浓度的细胞分裂素可高浓度生长素及适当浓度的细胞分裂素可以促进愈伤组织的形成。以促进愈伤组织的形成。（一）愈伤组织诱导（一）愈伤组织诱导51 由脱分化形成的愈伤组织细胞分化出不定由脱分化形成的愈伤组织细胞分化出不定芽及不定根的过程。芽及不定根的过程。分化过程受分化过程受细胞分裂素细胞分裂素/生长素比值生长素比值的影响。的影响。较高的细胞分裂素较高的细胞分

22、裂素/生长素易诱导不定芽的形成生长素易诱导不定芽的形成，较低的比值易诱导不定根的发生。，较低的比值易诱导不定根的发生。通常添加高浓度的细胞分裂素，降低生长素通常添加高浓度的细胞分裂素，降低生长素浓度或去除。浓度或去除。（二）不定芽的分化：（二）不定芽的分化：52 分化形成的不定芽切下后，接种于增殖分化形成的不定芽切下后，接种于增殖培养基中，促进不定芽的增殖，增殖的无根培养基中，促进不定芽的增殖，增殖的无根苗转接于生根培养基中可以诱导不定根的形苗转接于生根培养基中可以诱导不定根的形成。成。（三）不定芽的增殖及生根（三）不定芽的增殖及生根53 离体条件下对植物的根尖或根段等外殖离体条件下对植物的根尖或根段等外殖体进行培养，经脱分化及再分化等过程再生体进行培养，经脱分化及再分化等过程再生出完整植株的过程。出完整植株的过程。培养方法与叶片培养相培养方法与叶片培养相似。似。包括包括愈伤组织诱导、不定芽分化、无菌苗愈伤组织诱导、不定芽分化、无菌苗的增殖与生根的增殖与生根等。等。四、离体根培养四、离体根培养54 图图17 大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生552007042356