酵母型真菌的微生物学检验.doc

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1、 . 酵母型真菌的微生物学检验1检验程序 深部真菌检验程序见图23-8。2. 标本采集 根据感染部位的不同，采集不同的标本。采集标本时应避免病灶周围正常菌群污染。对于疑似隐球菌性脑膜炎患者，以腰椎穿刺术无菌采集脑脊液35ml，特殊情况可采用小脑延髓池或脑室穿刺术，标本采集后应立即送检。3标本直接检查(1)直接显微镜检查：取标本直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜下见到革兰阳性、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝(图23-6)，可确认为念珠菌感染。克柔念珠菌可见假菌丝成对称分枝，有细长的芽生孢子。光滑念珠莳镜下可见卵圆形芽生孢子，细胞尖端单芽，无真假菌丝，不产生厚壁孢子。用患者脑脊液作墨汁负染色检查是诊

2、断隐球菌脑膜炎最简便、快速的方法。常规细胞染色可发现隐球菌，但易误诊和漏诊。如用PAS染色后新生隐球菌呈红色。(2)G试验：也称螯试验，可测定1-3-D-葡聚糖，后者是多种不同种类真菌细胞壁的共有成分，部分可激活马蹄蟹的协同凝集酶-G因子，用显色反应经分光光度计可测定其浓度。血液及无菌体液中检出1-3-D-葡聚糖为深部真菌，如念珠菌、曲霉菌和酵母菌等感染的标志，但不能确定为何种深部真菌感染。(3)抗原检测：取患者血清做ELISA、免疫印迹法等检测白念珠菌抗原，如烯醇化酶、甘露聚糖抗原及念珠菌热敏抗原。(4)抗体检测：早期诊断可采用患者血清作ELISA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便、快速。也可

3、用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试验等检测血清中抗白念珠菌抗体。(5)核酸检测：用PCR法将白念珠菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏感性和特异性。现有学者提出用短肽噬菌体展示技术与ELISA结合，高分辨率熔解曲线与真菌通用引物PCR结合鉴定白念珠菌及其他念珠菌。4分离培养将标本接种在沙保弱培养基上，25或37培养14天后，白念珠菌可在培养基表面出现奶油色类酵母型菌落，镜检可见假菌丝和芽生孢子。热带念珠菌在沙保弱培养基上形成色暗而干燥的菌落。克柔念珠菌在沙保弱琼脂培养基上25培养23天，呈扁平、干燥、灰黄色、可见皱褶菌落。光滑念珠菌在沙保弱培养基上2537培养23天，形成奶油色乳酪样菌落

4、。将标本接种在沙保弱培养基上，病原性隐球菌在25和37培养的可生长，而非病原性隐球菌在37C时不生长。培养25天后观察菌落形态特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。5. 鉴定(1)念珠菌1)芽管形成试验：将念珠菌接种于0205ml人或动物血清中，37培养154小时，镜检观察有无芽管形成。白念珠菌可形成芽管，但并非所有的白色念珠菌都形成芽管，其他念珠菌一般不形成芽管。试验时应设立阳性对照(白色念珠菌)和阴性对照(热带念珠菌)。但热带念珠菌在血清中培养6小时或更久时也可形成芽管，所以要注意试验培养时间。2)厚膜孢子形成试验：将念珠菌接种于玉米粉培养基25培养12天后，仅白色念珠菌在菌丝顶端、侧缘或中

5、间形成厚膜孢子。3)糖同化或发酵试验：念球菌凡能发酵某种糖，一定能同化该糖，故只需做那些不被发酵糖的同化试验。糖发酵试验是将培养物接种糖发酵管，25培养，一般观察23天，对不发酵或弱发酵管可延长至10天或24周。同化试验所有的基础培养基含(NH4)2SO4、KH2P04、MgS047H2O、CaCl22H20、NaCl和酵母浸膏，试验时再分别加入各种糖。同时以葡萄糖和基础培养基作对照。观察结果时要观察有无酵母生长或液体培养基是否变混浊。各种念珠菌糖发酵及同化试验结果日表23-2。4)氯化三苯基四氮唑反应：取沙保弱培养基上的菌落接种至加入005g/L氯化三苯基四氮唑(TZC)的葡萄糖蛋白胨琼脂，

6、热带念珠菌在此培养基上生长后使培养基变为深红色或紫色，而自念珠菌不使培养基变色(淡红)，其他念珠菌使培养其变为红色。现在临床用商品化的显色培养基可快速鉴定白念珠菌和其他念珠菌(图23-9)。在显色培养基上，白念珠菌的菌落呈绿色或翠绿色，热带念珠菌呈蓝灰色或铁蓝色，克柔念珠菌呈粉红色或淡紫色，光滑念珠菌则形成白色或紫红色菌落。5)动物试验：将念珠菌悬液注射1ml于家兔耳静脉或注射02ml于小白鼠尾静脉，观察57天，注意动物是否死亡。剖检时如发现脏器有多种小脓肿，即为白念珠菌感染。其池念珠菌对动物无致病性。(2)隐球嗣属1)酚氧化酶试验：将菌落接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经25天培养，新生隐球菌呈棕黑色菌落。用已知新生隐球菌和浅白隐球菌分别作阳性和阴性对照。2)脲酶试验：新生隐球菌能产生脲酶，可分解尿素琼脂培养基的尿素形成NH4和CO2。使培养基pH升高，从而培养基由黄色变为粉红色。白念珠菌为阴性。3)糖同化及发酵试验：新生隐球菌能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇和棉子糖，但不能发酵糖和醇类，硝酸盐还原试验阴性。非致病性隐球菌则不能同化肌醇。4 / 4