酶联免疫吸附试验(ELISA).ppt

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1、实验五实验五 1.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)2.2.补体结合反应补体结合反应11.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)2免疫标记技术免疫标记技术1.1.定义：定义：将抗原将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放射性放射性同位素、酶或荧光素同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.2.分类：分类：放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCF

2、ITC，PEPE免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP3免疫酶测定法免疫酶测定法(E Enzyme nzyme I ImmunommunoA Assay,EIA)ssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)(HRP)(HRP)，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶(AP)(AP)(AP)(AP)特点：特点：特点：特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：

3、保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pgpgpgpg水平微量检测水平微量检测水平微量检测水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类：分类：分类：分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性

4、抗原或抗体酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。4酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗

5、原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。1.1.定义定义2.2.分类分类间接法（间接法（间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原竞争法（竞争法（竞争法（竞争法（Compe

6、titive ELISA)Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体5酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA

7、)3.3.原理原理（以间接性（以间接性ELISA为例）为例）：显色显色显色显色6实验内容：实验内容：间接法测定溶血素间接法测定溶血素 定性检测定性检测7实验材料实验材料脱纤维绵羊红细胞脱纤维绵羊红细胞 抗原抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）待测兔血清待测兔血清HRPHRP标记羊抗兔标记羊抗兔IgG IgG 二抗二抗包被缓冲液：包被缓冲液：0.05M pH9.60.05M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液洗涤液：含洗涤液：含0.05%Tween 200.05%Tween 20的的0.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：底物缓冲液：pH5

8、.0 pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：底物溶液：OPD 10mgOPD 10mg，底物缓冲液，底物缓冲液25ml25ml，30%H30%H2 2O O2 2 40L 40L酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪8实验方法实验方法1.1.抗原的处理：抗原的处理：脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血加加加加3mL N.S3mL N.S3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀，混匀，混匀2000rpm2000rpm2000rpm2000rpm，5min5min5min5min加加加加3mL N.S3mL N.S3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀，混匀，混匀2000rp

9、m2000rpm2000rpm2000rpm，5min5min5min5min取取取取2mL2mL2mL2mL压积红细胞压积红细胞压积红细胞压积红细胞加入加入加入加入2mL2mL2mL2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成1 1 1 1：400400400400备用备用备用备用2.2.包被抗原：包被抗原：取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/100L/100L/孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液4444，湿盒

10、内，湿盒内，湿盒内，湿盒内，18h18h18h18h9取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（4 4孔孔/组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待测血清加待测血清标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测4.4.加二抗：加二抗：3737，湿盒内，湿盒内，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标二抗各孔加入酶标二抗

11、100L/100L/孔孔3737，湿盒内，湿盒内，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min10min6.6.观察结果观察结果实验方法实验方法10预期结果预期结果阳性：显色为黄色阳性：显色为黄色阴性：无色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性11注意事项注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。包被

12、和温育在湿盒内进行。122.2.补体结合反应补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）13概念：概念：补体结合反应：补体结合反应：是指在是指在补体补体的参与下，以绵羊红细胞的参与下，以绵羊红细胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗SRBCSRBC的抗体）作为的抗体）作为指指示系统示系统的的抗原抗体反应抗原抗体反应。14补反中包括补反中包括两个系统两个系统五种成分：五种成分：待检系统：已知待检系统：已知AgAg或或AbAb、待检、待检AbAb或或AgAg及仅及仅供一组供一组Ag-AbAg-Ab系统反应的定量补体。系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶

13、血素。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：原理：15待测系统待测系统待测系统待测系统抗原抗原抗原抗原+未知血清未知血清未知血清未知血清1 2补体补体补体补体12Step 1 Step 1 抗原抗体复合物的形成抗原抗体复合物的形成抗原抗体复合物的形成抗原抗体复合物的形成Step 2Step 2补体的结合和耗竭补体的结合和耗竭补体的结合和耗竭补体的结合和耗竭指示系统指示系统指示系统指示系统SRBC+SRBC+抗抗抗抗SRBCSRBC抗体抗体抗体抗体Step 3Step 3SRBCSRBC的裂解的裂解的裂解的裂解121：No Ab；2：Ab16Ag待测血清待测血清 Ab阳性阳性No Ab阴性阴性Ag

14、AgAg17抗原：伤寒菌裂解产物抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：待测血清：56，30min补体：豚鼠血清补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞绵羊红细胞溶血素溶血素材料：材料：18方法：方法：12345试验管试验管试验管试验管血清血清血清血清对照管对照管对照管对照管抗原抗原抗原抗原对照管对照管对照管对照管补体补体补体补体对照管对照管对照管对照管SRBCSRBC对照管对照管对照管对照管待测血清待测血清待测血清待测血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.

15、2mL0.4mL0.4mL0.8mL0.8mL抗原抗原抗原抗原补体补体补体补体 N.S N.S摇匀，摇匀，摇匀，摇匀，3737，水浴，水浴，水浴，水浴15min15min溶血素溶血素溶血素溶血素SRBCSRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 摇匀，摇匀，37，水浴，水浴15min（1份份/2人）人）19预期结果：预期结果：1 1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。明呈红色为溶血。溶血溶血不溶血不溶血2.2.20绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。注意事项：注意事项：21