HIV病毒分子生物学检测技术最新进展.docx

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1、HIV病毒分子生物学检测技术最新进展 【摘 要】随着艾滋病感染患者的增多，为适应艾滋病大规模筛查和尽量早期诊断治疗的须要，目前艾滋病检测技术向着简易、快速、牢靠的方法的方向发展，HIV核酸检测的灵敏度和特异性显著提高，缩短检出HIV的窗口期，在艾滋病早期诊断和治疗以及艾滋病的预防方面发挥着重要作用，是HIV试验室诊断发展的主要方向。本文对HIV核酸检测的各种技术原理、特异性、牢靠性及临床好用性的前沿探讨进展进行综述。 【关键词】HIV病毒；分子生物学检测；进展 艾滋病病毒主要侵袭人体免疫系统，导致人体免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。艾滋病的不行治愈及其快速传播使患者不断增多，2022年全球感染

2、总人数已达3900万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发觉，为了防止艾滋病的大规模流行，艾滋病的检测工作更加重要。目前筛查的免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的传播扩散有重要意义。 1 HIV生物学特性 HIV呈圆形或椭圆形，直径900140nm，外层为类脂包膜，成分是外膜糖蛋白和跨膜糖蛋白，核心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构基因长末端重复序列、核心蛋白、聚合蛋白、包膜蛋白

3、gF，还有特别困难的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调整基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调整作用。HIV基因组中存在3个gag-pol- env.Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的外围，由主要的P24和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gp120和gp41，起帮助HIV进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关1。 依据env基因V3段

4、碱基排列的不同，HIV-1分为11个亚型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亚型，HIV-2分为6个亚型2，不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上有着重要意义。 2 HIV-1的感染机制及感染标记 病毒侵入人体后，通过病毒表面gpl20在化学因子CCR5或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41的帮助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下复制DNA，此DNA部分存留在胞浆内产生系列改变，然后在细胞膜上装配成新病毒

5、，再感染其它细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA，其次是p24抗原，最终是抗体3。 3 分子生物学检测技术 随着分子生物学检测技术快速发展，HIV RNA或DNA检测得到应用，核酸检测已是艾滋病试验室诊断的主要发展方向4，在HIV感染的监测、诊断、探讨、疗效视察及预后推断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两类。 3.2 定性检测 3.2.1 原位杂交 应用特定的标记探针以分子杂交法干脆检测标本中的HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来渐渐发展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合酶链反应略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛运用，基因探针技术也就渐渐失去应

6、用意义。 3.2.2 聚合酶链反应技术 PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术。基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延长三个基本反应步骤构成。患者感染HIV 114d后血浆中能检测出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗体检测不确定等状况的协助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的診断中有着特别重要的意义，前病毒DNA PCR检测法对诞生48h内的婴儿检测敏感性为38%，诞生14d的婴儿检测敏感性达93%5。 3.2.3 逆转录多聚酶链反应技术 RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现

7、，即将病毒RNA逆转录DNA，接着进行PCR，指数扩增DNA片段，将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR技术可在2h内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，精确定量的RT-PCR方法已被很多商业试验室证明，目前多种改良的快速RT-PCR检测方法应用于HIV的快速临床诊断6，7。 PCR灵敏度高、特异性强、操作简便，但易污染出现假阳性结果；此外，HIV基因的多样性，尚无一套引物能够覆盖全部的HIV序列，限制了检测敏感性，因此，阳性结果还须核酸序列测定加以确认。HIV核酸定性检测阳性结果可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断的协助指标，但不能单独用于HIV感染的确诊，

8、成为限制PCR对于HIV感染诊断的临床应用。 3.3 定量检测 HIV核酸定量检测即病毒载量测定，感染HIV后病情发展速度干脆与血浆中病毒载量呈正比。在其他血清学和病毒学标记出现前检出病毒核酸，使窗口期缩短611.5d，且慢性潜藏期也能检出，便于早期协助诊断；HIV病毒载量常用于用于评估疾病病程、监测抗病毒治疗成效、选择抗病毒治疗方案；还可用于鉴定诞生后18个月内的婴儿血液中的HIV-IgG抗体是否来自于母体，婴儿是否感染HIV。当前，常用的定量检测方法有较高的敏感性、特异性和可重复性。 第5页 共5页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页