microRNA—182在口腔鳞癌细胞中的表达及对细胞生物学行为的影响.docx

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1、microRNA182在口腔鳞癌细胞中的表达及对细胞生物学行为的影响 摘要 目的 检测microRNA-182在口腔鳞癌组织中的表达，探讨miR-182对口腔鳞癌细胞增殖和迁移实力的影响。 方法 收集2022年7月2022年10月哈尔滨医科高校附属口腔医院住院患者10例鳞状细胞癌标本和配对组织，实时荧光定量PCR方法检测miR-182 mRNA在口腔鳞癌组织中的表达水平。培育舌鳞状细胞癌细胞系TCA8113，分四组：空白比照组、空载体组、阴性比照组和miR-182-inhibitor组。利用MTT法和Transwell小室方法分别检测TCA8113细胞转染miR-182-inhibitor后的

2、增殖和迁移实力的改变。 结果 口腔鳞癌组织与配对组织比较，miRNA-182的表达显著增高。转染miR-182-inhibitor后，miR-182-i组细胞的增殖能力和细胞迁移数显著低于Control组、。 结论 miR-182的高表达可能与口腔鳞癌的发生发展有关，下调miR-182的表达可抑制TCA8113细胞的增殖迁移能力，其作用机制尚需进一步研究。 关键词 口腔鳞状细胞癌；微小RNA；miRNA-182 中图分类号 R739 文献标识码 A 文章编号 1673-731012-0017-04 Abstract Objective To investigate the expression

3、 of miRNA-182 in oral squamous cell carcinoma and explore the effects of miR-182 deficiency on proliferation and migration in OSCC cells. Methods 10 cases of OSCC samples and paired tissues were collected from Stomatological Hospital of Harbin Medical University from July 2015 to October 2016. The e

4、xpression of miR-182 in OSCC tissues was detected by quantitative reverse-transcription polymerace chain reaction . Culturing TCA8113 cells and separating the samples to four groups： Control， Vehicle， miR-182-NC and miR-182-i group. After transfection with miR-182 inhibitor， TCA8113 cell proliferati

5、on and migration were examined with MTT assay and Transwell assay. Results The level of miR-182 in OSCC samples was significantly higher than that in normal paired tissue group . The proliferation capability and migration capability in miR-182-i group were decreased than those in Control group . Con

6、clusion The high expression of miR-182 may be correlated with the development of OSCC. Decreased the expression of miR-182 may inhibite OSCC cancer cell proliferation and migration. Further study should be conducted to explore the function of miR-182 in OSCC development. Key words Oral squamous cell

7、 carcinoma； miRNA； miRNA-182 口腔鳞状细胞癌是头颈部较常见的恶性肿瘤，占全部口腔恶性肿瘤的73%90%，是头部和颈部癌症患者发病和死亡的主要缘由1。近二十年，虽然诊断技术和治疗手段不断提高和完善，口腔癌的发病率有所下降，但治疗效果仍旧不佳，仅5%患者的总体生存期有所改善，且5年生存率只有50%，局部复发率和远端转移率都高达25%2-3。目前口腔肿瘤的主要治疗方式为手术切除和放化疗，尤其放化疗后患者生存质量明显下降，常造成毁容和致残，因此口腔肿瘤的早期诊断和深化的发病机制探讨对于患者的治疗和预后具有重要意义4-5。全部癌症的发生和发展，包括口腔肿瘤，都与某些抑癌基因或

8、致癌基因的表達异样亲密相关6。MicroRNA是近年来发觉的广泛存在于真核生物中，序列高度保守的由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参加细胞增殖、分化、凋亡和存活等多种生命过程的调整7。microRNA-182属于miR-183/96/182簇的一员，具有高度同源的microRNA序列，在各物种间高度保守。有探讨者对已发表的49篇文献进行综合分析，结果显示miR-182在15种肿瘤组织中表达上升，其中包括直肠癌、前列腺癌、肺癌等，并对其下游的靶基因进行了分析，发觉大部分是肿瘤相关基因8-9。而miR-182与口腔肿瘤的关系相关报道甚少。本试验通过对口腔肿瘤组织中miR-

9、182 mRNA表达水平的检测，视察miR-182对口腔鳞癌细胞增殖和迁移实力的影响，探讨其在口腔癌中发生、发展过程中可能的作用机制，为将来其作为分子标记或药物靶点供应思路和科学线索。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 临床样本 选择2015年7月2016年10月于哈尔滨医科高校附属口腔医院颌面外科接受手术治疗的OSCC患者10例，均经病理确诊。癌旁正常组织定义为病灶周圍病理检查未见OSCC细胞的组织。患者平均年龄为岁，其中，男6例，女4例。全部患者均签署知情同意书。全部患者术前均未接受过放疗或化疗。组织提取后置于-73C低温冰箱中保存，备用。 1.1.2 细胞系 人舌鳞癌细胞系TCA

10、8113，购自哈尔滨医科高校中心试验室。 1.1.3 试剂 RPMI-1640购自Gibco公司；胎牛血清购自Gibco公司；miR-182-inhibitor购自上海吉玛制药技术有限公司；反转录试剂盒购自Promega公司；MTT试剂盒购自Sigma公司。 1.1.4 主要仪器设备 倒置显微镜购自Olympus 公司，酶标仪购自Labsystems Ascent公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培育 人口腔癌TCA8113细胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培育基培育，培育条件：37C、5%饱和湿度的恒温密闭CO2培育箱。倒置显微镜下视察细胞生长。用胰酶消化细胞，每3天传代1次，

11、取对数生长期细胞用于试验。 1.2.2 逆转录和实时荧光定量PCR Trizol法提取口腔鳞癌组织中总RNA，测量OD260/OD280值均在1.82.0之间，提取后储存于RNA保存液，后溶于DEPC水中，保存于-73C低温冰箱。根据反转录试剂盒说明书进行操作，反应运用SYBY green 1作为荧光检测信号。Real-Time RT-PCR所用引物如下：上游5-GT？鄄GCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3，下游5-CCAGTGCA？鄄GGGTCCGAGGT-3。运用SYBR Prime Script RT-PCR Kit定量扩增体系进行扩增。反应总体积10 L：cDNA 1 L，引

12、物 0.4 L，SYBR Primix Ex TaqTM 5 L，加RNase H2O至10 L。实时荧光定量PCR反应程序条件设置为：94C预变性15 min，94C 30 s，55C 50 s，73C 45 s，进行30个循环。以RNA U6为内参，每个样品均设置3个复孔，目标基因的相对定量采纳2-ct计算。 1.2.3 MTT法检测细胞增殖率 收集处于对数生长期的TCA8113细胞，制成浓度为4104个/mL的细胞悬液，于96孔培育板内每孔加入200 L细胞悬液，制作通过瞬时转染miR-182 inhibitor抑制miR-182表达的试验组模型。试验分四组：空白比照组、空载体组、阴性比

13、照组和miR-182-inhibitor组。转染时间分别为24、36、48、60、73 h，每孔加入MTT试剂20 L，4 h后终止培育，弃上清加入DMSO。根据试剂盒说明书操作，记录酶标仪490 nm处吸光值。试验重复3次。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。 1.2.4 Transwell法检测细胞迁移 试验组miR-182 inhibitor转染细胞培育24 h后，胰酶消化制作细胞悬液密度为2105个/mL。将101 L无血清培育基稀释的细胞悬液接种于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培育液，接着培育24 h，PBS冲洗2次，甲醛固定30

14、 min，结晶紫染色25 min，倒置显微镜视察迁移至小室下层的细胞个数。试验重复3次。 1.3 统计学方法 采纳Minitab 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数标准差表示，两组间比较采纳t检验；多组间比较采纳单因素方差分析，组间两两比较采纳SNK检验，以P 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-182表达水平检测 Real-Time RT-PCR结果显示，鳞癌组织中miR-182的表达水平明显高于正常癌旁组织，差异有统计学意义。见图1。 2.2 细胞增殖实力检测 结果显示，miR-182-i组转染miR-182-inhibitor后，TCA8113细胞在3

15、6、48、60、73 h处的增殖率显著低于Control组，而Vehicle组、miR-182-NC组与Control组相比差异无统计学意义。见图2。 2.3 细胞迁移实力检测 结果显示：转染miR-182-inhibitor后miR-182-i组TCA8113细胞的迁移数个数为，Control组为，Vehicle组为，miR-182-NC组为，miR-182-i组的细胞迁移率明显低于Control组，Vehicle组、miR-182-NC组与Control组相比差异无统计学意义。见图3。 3 探讨 近年来探讨发觉，尽管miRNA占人类基因组不到1%，却在机体的生理调控过程中起着至关重要的作用

16、，调控人类约1/3基因的表达。miRNA在转录后水平对基因表达的精细调控受到广泛关注10-11，越来越多的证据表明miRNA在多种肿瘤的发生发展中起着癌基因或抑癌基因的作用，既参加恶性肿瘤的发生和发展，又可抑制恶性肿瘤的形成和转移，在肿瘤细胞的各种代谢和活动中发挥重要作用。 2003年首次发觉miR-182，定位于人7号染色体，与miR-96、miR-183形成一个基因簇12。miR-182的异样表达可能参加了许多疾病的发生发展，如肿瘤、自身免疫性疾病、抑郁症、代谢性疾病等。近年来，大量探讨证明，miR-182参加多种恶性肿瘤的进程，如消化道肿瘤、肺癌、胶质瘤等，但探讨发觉miR-182的作用

17、机制困难，在某些恶性肿瘤中起着抑癌基因的作用，抑制肿瘤的发展和转移实力，而在某些恶性肿瘤中却又起着促癌基因的作用，高表达并增加肿瘤细胞的侵袭和转移实力13-16。 OSCC是頭颈部常见的恶性肿瘤，目前的治疗方法主要是手术切除和放化疗，术后复发率及颜面部的功能损伤使治疗效果不让人满足17-19。随着分子生物学技术的发展，找寻分子生物治疗或许会给OSCC的治疗供应新的思路20。本试验通过检测OSCC组织和配对正常组织中miR-182的含量发觉，口腔鳞癌组织中miR-182表达高于正常配对组织，且差异有统计学意义。本探讨所选10例临床标本中，其中8组配对标本miR-182的表达水平试验组显著高于比照

18、组，一组表达试验组表达水平略低于比照组，一组表达水平相同，均为低水平表达。由于本试验的样本量有限，在后续试验设计中，应增加样本量一步验证miR-182在OSCC组织中的表达状况。 增殖试验结果显示，转染miR-182-inhibitor后TCA8113细胞的增殖实力与Control组相比，在各时间点均降低，而Vehicle组、miR-182-NC组与Control组差异无统计学意义。提示miR-182-inhibitor可显著抑制TCA8113细胞增殖实力，因此推断在OSCC细胞中，miR-182可能有助于肿瘤细胞的增殖，起到癌基因的作用。为了探讨miR-182对口腔癌细胞的侵袭实力的影响，T

19、ranswell小室检测结果显示TCA8113细胞转染miR-182 inhibitor后，miR-182-i组细胞穿透基质胶进入到下室的细胞数量明显少于Control组，而其他三组Control组、Vehicle组和miR-182-NC组之间差异无统计学意义。提示缄默miR-182后TCA8113细胞的迁移实力显著降低，miR-182与OSCC肿瘤细胞的转移亲密相关，miR-182可以增加OSCC细胞的侵袭实力。 综上所述，miR-182在OSCC组织中表达上升，缄默miR-182可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移实力，从而抑制肿瘤细胞的生长。miR-182在OSCC肿瘤细胞中起着癌基因的作用，提高

20、细胞的增殖和侵袭实力。本试验为miR-182作为OSCC的协助诊断指标以及预防治OSCC供应试验依据，为OSCC的生物治疗供应理论基础。 参考文献 1 Lawal AO，Adisa AO，Effiom OA. A review of 640 Oral squamous cell carcinoma cases in Nigeria J. J Clin Exp Dent，2022，9：e767-e773. 2 Minhas S，Kashif M，Altaf W，et al. Concomitant-chemoradiotherapy-associated oral lesions in pati

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