AIDA—1基因的克隆与鉴定.docx

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1、AIDA1基因的克隆与鉴定 摘要：为了克隆AIDA-1基因并对其定序，通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1基因，通过酶切的方法克隆到pMD19-T simple载体中，再转化入感受态大肠杆菌，并通过基因测序的方法测定了AIDA-1的序列。 结果表明：胜利克隆并测定了AIDA-1的序列，为蛋白展示、疫苗开发供应了重要的材料。 关键词：克隆； 测序； AIDA-1基因 中图分类号：Q36 文献标识码：A 文章编号：16741014408018401 1 引言 AIDA-1为革兰氏阳性菌的IV型分泌系统，可在革兰氏阴性菌表面形成桶装结构，展示其N-端携带的蛋白13。IV型分泌系统在革

2、兰氏阴性菌表面展示外源蛋白的过程中，无需其他因子的协助，因此是便利高效的细菌表面展示系统。该展示系统在疫苗的研制及表位筛选等方面具有很大的优势。本探讨拟通过PCR方法，获得AIDA-1基因。 2 材料与方法 2.1 引物设计 依据NCBI上公布的AIDA-1的序列设计了上、下游引物。 2.2 PCR扩增 取1 mL對数生长期的大肠杆菌E393，煮沸10 min，12000 rpm离心2 min，取上清作为PCR模板46。PCR反应体系为50 L其中包含：5 L大肠杆菌模板，5 L PCR反应缓冲液，1 L dNTP，上、下游引物各1 L，Taq酶1 L，灭菌超纯水36 L。将PCR反应混合液混

3、匀后，通过如下程序进行PCR扩增：94 4 min，94 1 min、 57 1 min、73 2 min 共30个循环，73 10 min， 4 10 min。取20 L的PCR产物，在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为80 V 50 min。 2.3 PCR产物的回收及连接 根据凝胶回收试剂盒说明回收AIDA-1产物。分别取4 L PCR产物、1 L pMD19-T simple载体及5 L连接缓冲液，轻轻混匀后置于4 连接过夜。 2.4 转化及序列测定 取10 L连接产物，加入到101 L簇新的DH10B的感受态细菌中，轻轻混匀，冰浴30 min；在42 水浴锅中热休克90s；马上加入8

4、00 L的LB培育基，并轻轻混匀，置于37 摇床中培育50 min。取400 L培育物涂布于含有IPTG、V-gal及氨苄青霉素的LB平板中，37 培育过夜。挑取平板上的白色菌落进行测序分析。 3 结果与结论 通过PCR胜利扩增出目的片段，经DNA测序表明AIDA-1基因被胜利克隆至T载体中。克隆的AIDA-1基因片段，可广泛应用于革兰氏阴性菌表面展示。该表面展示系统可以在细菌表面展示外源蛋白，可与流式细胞术等高通量的检测及分别方法结合，应用于疫苗的制备、生物吸附剂的研制及抗原表位的筛选等领域。因此，本探讨克隆的AIDA-1基因为我们后期的探讨供应了材料基础，具有广泛的应用前景和应用价值。 参

5、考文献： 1Stordeur P， Marlier D， Blanco J， et al. Examination of Escherichia coli from poultry for selected adhesin genes important in disease caused by mammalian pathogenic E. coliJ. Vet. Microbiol， 2002， 84：23141. 2吴琛耘，吴建和，刘晶星.细菌的型和型分泌系统J.国外医学，2004，27：1921. 3原志伟，朱国强.细菌I型分泌系统探讨进展J.生物技术通讯，2022，18：129131. 4张少峰，刘国强，魏春雷，等。粪大肠杆菌检测方法及探讨进展J. 海洋通报，2022，27：102106. 5罗 樨，王 强，赫 然，等。大肠杆菌质粒DNA PCR模板的快速制备J.生物技术，2002，11：38. 6苏应斌，莫道君，戴天力.改进的PCR模板制备及DNA回收方法J.湖北医科高校学报，19101，18：2425. 第4页 共4页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页