ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备.docx

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1、ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备 农业科学院热带生物技术探讨所刘志昕试验室惠赠，大肠杆菌菌株DH5和BL21感受态细胞感受态购自天根生化科技有限公司。rTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶，T4连接酶购自Fermantas公司，PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP与BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。本试验所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技术有限公司合成。 1.2 ShSA

2、P1原核表达载体的构建 由甘蔗cDNA扩增ShSAP1基因阅读框，所用引物为PETZP1和PTEZP2，PCR反应条件为：94 3 min；94 30 s，60 30 s，73 1 min，30个循环；73 10 min。纯化PCR产物，用限制性内切酶BamH和Hind对纯化后PCR产物和pET32a质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物酶切片段和pET32a大片段，用T4连接酶连接转化DH5，重组质粒进行酶切验证后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得原核表达载体pET-ShSAP1。 1.3 融合蛋白的小量表达 将pET32a与测序验证后的原核表达载体pET-ShSAP1转

3、化BL21，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培育基中，37 、200 r/min培育。培育至D=0.60.8，各取1 mL分装于灭菌的1.5 mL EP管中，加等体积35%甘油，混匀，-73 保存。试管中剩余菌液用加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导，37 、200 r/min培育 34 h。超声波破裂菌体，取1.5 mL的EP管，分别取1 mL破裂后的菌液，12 000 r/min离心1 min。沉淀用101 L的无菌水吹散。分别取10 L上清和10 L沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，考马斯亮蓝R-250染色30 min后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式及

4、表达量。 1.4 融合蛋白的大量表达与纯化 将小量表达验证过的pET32a和pET-ShSAP1菌液进行划线培育，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培育基中，于37 活化培育8 h后，以1 101稀释到400 mL含有Amp的LB液体培育基中，振荡培育至D600 nm值达到0.60.8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，接着于 37 培育8 h诱导蛋白表达。8 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清，加入30 mL Binding Buffer重悬，运用超声波破裂法在冰浴中对菌体进行破裂，8 000 r/min离心10 min，分别裂解液上清保存，取10

5、 L上清液进行SDS-PAGE分析。 蛋白纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡亲和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer洗脱杂蛋白，再分别以由低至高的咪唑浓度的6 mL Elute Buffer洗脱融合蛋白，取10 L洗脱液进行SDS-PAGE分析。同时，将纯化蛋白送往北京华大基因测序中心进行质谱测序分析。选取浓度与纯度较好的洗脱液进行1PBS透析，透析3次后进行蛋白浓度测定既可用于免疫兔子，蛋白浓度=1.45D280 nm-0.74D260 nm6。 1.5 抗血清的制备和效价测定 将纯化并透析过的融合蛋白作为免

6、疫原对一般成年大白兔进行免疫，每次免疫加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射。每隔8 d 进行1次免疫，第4次免疫后第5天耳静脉采血，分别血清，以ShSAP1纯化融合蛋白为抗原进行ID-ELISA 测定，以免疫前家兔血清作為阴性比照，PBS作为空白比照。效价检测合格后进行颈动脉采全血50 mL，血液处理如下：37 静置1 h，4 静置过夜，5 000 r/min离心15 min，吸取上清于50 mL离心管，再次5 000 r/min离心，15 min，吸取上清，留出近期运用量28 存放，其余分装后置于-73 。 2 结果与分析 2.1 ShSAP1的原核表达的构建 用引物PETZP1与PETZ

7、P2从甘蔗cDNA扩增得到带有BamH/Hind酶切位点的530 bp目标产物，将PCR产物纯化后和载体pET32a分别进行BamH和Hind双酶切，回收PCR酶切产物和pET32a大片段进行连接转化DH5a，对重组质粒进行BamH和Hind双酶切验证，可以切下530 bp左右的目的条带载体经测序鉴定后，结果正确，构建成ShSAP1的原核表达载体pET-ShSAP1。 2.2 ShSAP1的小量表达与表达模式的确定 将pET32a与pET-ShSAP1重组子质粒转化大肠杆菌BL21，筛选出阳性克隆，小量培育至D值为0.7左右，加IPTG诱导3 h，收集菌体进行超声波破裂细胞后，离心分出上清与沉

8、淀，分别取10 l上清和10 l沉淀悬浮液进行SDS-PAGE电泳，pET-ShSAP1菌体裂解液上清在约35 ku处出现1条蛋白带，而比照pET32a上清无此带。ShSAP1基因编码173个氨基酸，预料蛋白分子量约为18.3 ku，融合蛋白的氨基酸总数为332个左右，表达出的融合蛋白ShSAP1-His大小约为35 ku，大小与SDS-PAGE所测大小相符，初步表明ShSAP1在大肠杆菌中表达胜利。ShSAP1在疏水性分析结果表明，ShSAP1编码的氨基酸序列中，具有多个明显的亲水区域，大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸，推想ShSAP1属于亲水性蛋白；由pET-ShSAP1的菌体裂解液沉淀悬浮

9、液的电泳结果可以说明，ShSAP1-His融合蛋白主要存在于上清中，确定ShSAP1为可溶性蛋白。 2.3 ShSAP1的大量表达及纯化 经过大量诱导，PET-ShSAP1菌表达出了丰度较高的目标融合蛋白。将ShSAP1的粗蛋白上清用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析柱进行纯化，其中Elute Buffer的imidazole浓度为101 mmol/L时洗脱纯度和浓度较好，以该浓度下的洗脱产物进行电泳，测定纯化后的表达产物浓度为0.805 mg/mL。将纯化蛋白条带切下送往华大基因测序，质谱所得部分氨基酸序列经比对后发觉与甘蔗ShSAP1推导蛋白氨基酸序列具有一样性，说明ShSAP1在大肠杆菌

10、中得到了正确的表达。 2.4 ShSAP1抗血清的效价测定 将纯化后并经过透析的融合蛋白作为免疫原，采纳肌肉与皮下注射相结合免疫家兔，4次注射后进行抗血清的效价测定。以蛋白溶液为抗原进行 ID-ELISA 测定，以表达的ShSAP1融合蛋白作抗原，抗血清稀释125 000倍后仍明显地呈阳性反应。效价推断标准为大于最大D405 nm的一半的最小D405 nm所对应的稀释度，即为1 25 000。 3 探讨 植物对逆境的适应主要依靠激活抗逆相关调控因子如DREB、MYB/MYC、NAC、AREB等转录因子7，激活下游的抗逆效应基因，这些基因可能是抗逆代谢途径中的关键酶如SOD、POD8，也可能是干

11、脆起作用的抗逆效应蛋白如热激蛋白等9。有探讨表明一些抗逆基因能够提高原核表达重组菌的抗胁迫实力10-12。ShSAP1的表达能被高盐诱导，在进行ShSAP1融合蛋白抗血清制备的同时，我们通过在培育基和培育平板中添加不同浓度的NaCl对pET-ShSAP1重组菌进行了抗盐性鉴定，结果未发觉该重组菌表现出抗盐特征，说明ShSAP1在BL21原核系统中无增加宿主菌抗盐胁迫的实力，可能是由BL21中没有与ShSAP1相互作用的抗逆应答因子所致。本探讨对甘蔗ShSAP1进行了原核表达与蛋白纯化，得到了与预期蛋白大小一样的融合蛋白，并制备了ShSAP1的抗血清，为今后转基因植株检测和蛋白质功能探讨奠定了基

12、础. 参考文献： 1Giri J，Dansana P K，Kothari K S，et al. SAPs as novel regulators of abiotic stress response in plantsJ. Bioessays，2022，35：639-648. 2Giri J，Vij S，Dansana P K，et al. Rice a20/AN1 zinc-finger containing stress-associated proteins and a receptor-like cytoplasmic kinase interact via a20 zinc-fing

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