毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选.docx
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1、毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选 摘 要 建立了毛细管区带电泳技术快速测定D1蛋白酶活性及其抑制剂先导化合物的筛选方法。试验选用未涂层熔融石英毛细管作为分别介质，运行电压18 kV，测定了D1蛋白酶的活性并对部分抑制剂先导化合物进行了筛选。结果表明, ITP26和ITP21两种异GFDA1唑噻唑哌啶类先导化合物对蛋白酶活性具有抑制作用，抑制率分别为26%和13%。 关键词 D1蛋白酶； 毛细管区带电泳； 活性； 先导化合物 1 引 言 D1蛋白酶是由叶绿体核ctpA基因编码、含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白，分子量约为45 kDa，广泛存在于各种生物体中1。其作用
2、主要是通过剪切D1蛋白前体C端延长的肽段，促使其转化成具有活性的D1蛋白，用于光合系统II中锰簇复合物的组装，是植物进行光合作用所必需的步骤，因此D1蛋白酶被认为是一种新型优异的广谱除草剂作用靶标2。 开发以D1蛋白酶为靶标的新型农药，首先须要获得具有生物活性的重组蛋白酶和选择合适的先导化合物抑制活性筛选方法。D1蛋白酶活性检测通常采纳两种方法：一是采纳前体蛋白作为反应底物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 迁移检测反应产物3；二是以合成的D1 前体蛋白剪切位点旁边的肽段作为反应底物，剪切后的肽段采纳高效液相色谱进行分别和检测4。前者凝胶迁移法精确度较低，不适合大规模操作；后者的精确度较高，但由于采纳高
3、效液相色谱法，分析过程耗时较多，也不适合快速和高通量筛选的要求。毛细管电泳具有灵敏度高、环境污染少、进样量小、样品不需前处理、操作简洁等优点，在生物工程、药物分析和检测等领域获得了广泛应用，可用于多肽分别和蛋白质的分析57。本探讨采纳毛细管区带电泳建立了重组D1蛋白酶生物活性的测定方法，并用于抑制剂先导化合物筛选。 2 试验部分 2.1 仪器与试剂P/ACE MDQ 型毛细管电泳仪；熔融石英毛细管柱；KTA purifier 101 蛋白纯化系统。9肽、24肽均由上海吉尔生化公司合成；异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷；其它试剂均为国产分析纯。 2.2 试验方法 2.2.1重组蛋白酶的表达和纯化 D
4、1蛋白酶的表达和纯化参照文献 8的方法，将纯化得到的蛋白溶液超滤浓缩，采纳HiTrap脱盐柱除去咪唑，进行SDS-PAGE电泳鉴定和分析。 2.2.2 毛细管电泳分别条件的选择 毛细管电泳分别选用磷酸盐缓冲液，以未涂层的石英毛细管为分别柱混合后首先在25 恒温水浴中放置30 min，使二者充分结合，然后进行酶活性的测定。分别以缓冲液和DMSO代替化合物溶液作为阴性比照和阳性比照，依据24肽汲取峰面积的改变计算抑制率。 3 结果与分析 3.1 D1蛋白酶的表达和纯化 为了获得具有较高生物活性的重组D1蛋白酶，对表达条件进行优化，通过选择降低诱导剂的运用浓度和诱导温度，获得了可溶性表达的重组蛋白酶
5、。采纳亲和层析法纯化得到的蛋白酶纯度可达到95%以上，比活力为1.10 为文献9的15倍，可用于毛细管电泳分析。 3.2 电泳分别条件的优化 3.2.1 缓冲液pH值对分别的影响 运行缓冲液pH值在210范围内对多肽保留时间影响的结果如图2所示。在pH值68范围内，两种多肽达不到完全分别的要求。将pH值提高至910时，化合物的保留时间有所差别，但差别较小。而将pH值降低至25后，两种小肽的分别度增大。其缘由是高pH值条件下, 毛细管柱内壁表面的硅羟基发生电离, 其表面负电荷密度增加, 导致电渗流增大，缩短了待测物的出峰时间。随着pH值的降低, 硅羟基的电离受到抑制, 电渗流也相应降低。当pH3
6、后, 质子化作用使得电渗流趋于零, 此时pH值的变更对电渗流的影响较小10。本试验确定最适pH值为3。 3.2.2 缓冲液浓度对分别的影响 缓冲液浓度为20和30 mmol/L时，两种多肽的迁移时间较短，分别度较低，峰形较宽。浓度增大至50 mmol/L时，多肽的迁移时间增大，但谱峰变得较为尖锐，分别度也相应提高。其缘由在于增大缓冲液浓度后, 溶液的离子强度增加，毛细管内壁的双电层压缩，减小了电渗流, 待测物的迁移速度降低, 迁移时间增加。 增大缓冲液的浓度可以减弱样品之间以及样品与毛细管壁间的相互作用, 从而削减谱带变宽, 提高分别效率11。但当浓度进一步增大到高于50 mmol/L时，会导
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