壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究.docx

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1、壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究 摘 要：设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz)，以壳寡糖(COS)为材料，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并探讨其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COSEGFR DRz复合体转染效率为88.7%，与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RTPCR结果显示，经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA，使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0G1期，并且出现凋亡现象，其中COS组的凋亡率为19.3%，大于比照组脂质体的凋亡

2、率13.0%.探讨表明，COS较脂质体有相像的转染效率和更低的毒性，是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体. 关键词：壳寡糖；脱氧核酶；EGFR；基因递送 中图分类号：Q74 文献标识码：A Experimental Study of the Oligochitosan Nanoparticles of Intracellular EGFR DNAzyme Delivery LI Dan,WANG Bei, LIN Yiting, JIN Ran, LIU Zhiwen, LIU Xuanming (Research Center of Biological Energy Sources and

3、 Biomaterial, School of Biology, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410182, China) Abstract: A new intracellular gene delivery system based on oligochitosan (COS) was prepared and proven to be effective. First of all, The DNAzyme targeting EGFR (EGFR DRz) was designed and synthesized. Then, the biological

4、effect of the EGFR DRz delivery system based on COS was studied in Hela cell with Flow Cytometry. It was shown that there was no statistically significant difference in transfection efficiency between liposome transfection reagent (89.7%)and COSEGFR DRz (88.7%) . The results of semiquantitative RTPC

5、R confirmed that the EGFR mRNA in Hela cell could be cleaved by targeting COSEGFR DRz. The cell cycle analysis in Hela cells transfected with COSEGFR DRz revealed an arrestment in the G0/G1 phase. And the cell apoptosis rate induced by COSEGFR DRz was 19.3%, which was higher than the rate induced by

6、 liposomeEGFR DRz (13.0%). These results have demonstrated that COS possesses higher transfection efficiency and lower cytotoxicity. It will be a potential DNAzyme delivery system. Key words:oligochitosan; DNAzyme; EGFR; gene delivery 脱氧核酶(DNAzyme， DRz)是一种能特异性结合并切割靶RNA分子的酶性DNA，具有高效的催化降解实力和反义靶向识别实力1，

7、被广泛用于肿瘤、遗传病等疾病的探讨.脱氧核酶作为一种新型的靶基因缄默手段，其最主要的问题之一是如何有效地进入靶细胞.因此，找寻一种相容性好、在生物体内能够稳定递送基因的材料在基因治疗中具有广泛应用的价值和意义. 作为壳聚糖的降解产物，壳寡糖(oligochitosan, COS)无毒、无副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性2 .探讨显示，COS能爱护DNA免于被DNase I降解，证明白COS应用于基因载体的可行性与平安性3.同壳聚糖这种生物大分子相比，COS还具有很多独特的功能性质，如水溶性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性等4.基于壳寡糖的纳米药物/基因递送系统已成为药物/基因治疗探讨的

8、热点之一. EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，在多种肿瘤组织中有高表达，与肿瘤的发生发展和生物学行为亲密相关，被认为是肿瘤基因治疗的潜在志向靶点5.基于此，本文以COS为递送载体，以靶向EGFR的脱氧核酶为探讨对象，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并探讨其介导的脱氧核酶在肿瘤细胞内的生物学效应. 1 材料与方法 1.1材料 Hela细胞(ATCCCCL2)在10%小牛血清(Gibco BRL 公司)的RPMI 1640培育基(赛莫飞世尔公司)中进行常规培育.总RNA提取试剂TRIZOL和Taq酶等购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自安比奥. 1.2 EGFR脱氧核

9、酶的设计与合成 由NCBI的GenBank获得 EGFR cDNA保守序列，根据文献6方法进行靶向EGFR 的脱氧核酶的设计和筛选，获得序列EGFRDRz： 5aggcggggaGGCTAGCTACAACGAtcgggcgga3; FITC标记的EGFRDRz：5FITCaggcggggaGGCTAGCTACAACGAtcgggcgga3； Control DRz: 5aggcggggaGGGATCGTACA ACGAtcgggcgga3. 上述序列由Invitrogen公司合成.其中，对序列的前后各三个碱基进行硫代磷酸化以增加其稳定性. 1.3 COSEGFR DRz复合物的制备与表征 CO

10、S(金壳生化)用1%的醋酸洗涤，0.22 m的滤网过滤，冻干，用PBS(pH6.5)配制成20 mg/mL的溶液，过滤灭菌7.在水溶液中，COS分子表面带正电荷，EGFR DRz分子表面带有负电荷，利用静电吸附加以震荡可形成COSEGFR DRz复合物.无菌条件下在1 mL 1640 培育基中分别加入不同比例的COS溶液和EGFR DRz，置于摇床震荡10 min即可.利用Zeta 电位粒度分析仪对COSEGFR DRz复合物的大小进行表征分析. 1.4 COSEGFR DRz复合物的细胞转染效率分析 选对数生长期的Hela细胞, 用含抗生素的无血清培育基以105 个细胞/孔接种于6 孔板内培

11、育过夜，分别以COS和脂质体oligofectmineTM(Invitrogen)为递送载体，将FITC标记的EGFR DRz转染细胞，24 h后收集细胞，73%冷乙醇固定过夜.PBS 洗2 次, 用流式细胞仪检测带荧光的细胞比例. 1.5 COSEGFR DRz复合物在细胞内的分布 选对数生长期的Hela细胞, 根据步骤1.4进行转染，经过24 h培育，DHanks清洗2次，DAPI染色，在激光共聚焦显微镜下视察复合物在细胞内的分布状况. 1.6 COSEGFR DRz复合物对EGFR mRNA的切割活性检测 选对数生长期的Hela细胞, 根据步骤1.4进行转染.24 h后提取总RNA，逆转

12、录，用半定量PCR的方法检测转染前后EGFR mRNA水平的改变.其中，EGFR上游引物序列为：5 ctt gca gcg ata cag ctc aga 3；下游引物序列为：5 tcc tgg tag tgt ggg tct ctg c 3，扩增产物长度为189 bp.actin上游引物序列为：5 tta gct gtg ctc gcg cta ctc tct c 3, 下游引物序列为：5 gtc gga ttg atg aaa ccc aga cac a3，扩增产物长度为168 bp.10 L 反应体系加入dNTPs，上、下游引物(20 mol/L)各0.2 L 和Taq酶(4 U/L)0

13、.2 L.反应条件为94 40 s，60 30 s，73 40 s，35个循环，最终1个循环73 10 min.RTPCR产物经1.8 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色视察. 1.7 COSEGFR DRz复合物对细胞周期和细胞凋亡的影响 选对数生长期的Hela细胞, 根据步骤1.4进行转染.24 h后73%乙醇固定过夜，PBS洗2次，流式细胞仪检测细胞的周期分布和细胞凋亡.其中空白比照为不加任何转染试剂的正常培育条件下的Hela细胞. 2 结果与探讨 2.1 COSEGFR DRz复合物表征分析 采纳Zeta电位粒度分析仪对COSEGFR DRz复合物的稳定性和粒径进行分析.如图1所示，固定EGF

14、R DRz 的浓度为2 mol/L，当复合物中COS的质量浓度为0.4 mg/mL时，放置24 h后，其粒径没有发生显著改变，相对其他配比组要稳定，在本试验中我们选用此配比为最适配比.图2显示，脂质体包袱的EGFR DRz复合物粒径在240 nm左右，尽管COSEGFR DRz复合物的粒径略大，在500 nm左右，但文献显示，当转染复合物的粒径在2301 290 nm范围内时对其转染效率没有影响8.并且，目前也并没有证据能干脆证明粒径与转染率之间有相关性9. COS质量浓度/ 图1 COS质量浓度梯度对粒径的影响 Fig. 1 The effect of COS concentration o

15、n nanoparticle size 图2 不同载体复合物的粒径分布图 Fig. 2The size analysis of different DRz/carrier complexes 2.2 COSEGFR DRz复合物的细胞转染效率分析 采纳流式分析COS 携带EGFR DRz进入细胞的递送效率.如图3所示，空白比照只有微弱的本底荧光，COS的转染效率为88.7%，与脂质体的转染效率(89.7%)特别接近.此外，当脂质体和COS共同转染EGFR DRz时，其转染效率在90%左右.结果表明COS是脱氧核酶的有效细胞内递送载体. 图3 流式细胞术对不同载体转染效率的分析 Fig. 3Th

16、e transfection efficiency analysis of different carriers by Flow Cytometry 2.3 COSEGFR DRz复合物在细胞内的分布 采纳DAPI染色试验进一步分析COS能否有效地递送EGFR DRZ到细胞内.图4是COSEGFR DRz复合物转染Hela细胞后的激光共聚焦结果，绿色荧光是FITC标记的EGFR DRZ，可以看出经壳寡糖递送的EGFR DRz胜利地进入了细胞内，在细胞核与细胞质均有分布.并且，还可视察到部分细胞染色质浓缩，呈现浓聚的蓝色荧光，提示经EGFR DRz靶向识别的细胞发生了凋亡. 图4 EGFR DR

17、z在Hela细胞内的分布 (500) Fig. 4 The distribution of EGFR DRz in Hela cell (500) 2.4 COSEGFR DRz复合物在肿瘤细胞内的切割活性分析 采纳半定量RTPCR进一步分析COSEGFR DRz复合物能否有效地切割靶分子.从图5可以看出，与无EGFR mRNA切割活性的control DRz相比，经脂质体或COS转染的EGFR DRz能明显导致EGFR mRNA表达水平降低，再次证明经COS递送的EGFR DRz能够有效地进入Hela细胞，并实现对靶基因的靶向切割活性. 1空白比照；2脂质体转染的EGFR DRz 3脂质体转

18、染的control DRz; 4COS转染的EGFR DRz 5COS转染的control DRz; 6脂质体和 COS共转染EGFR DRz 7脂质体和COS共转染control DRz 图5 COSEGFR DRz复合物在Hela细胞内的切割活性分析 Fig. 5 The cleavage activity analysis of COSEGFR DRz complexes in Hela cell 2.5 COSEGFR DRz复合物对细胞周期和细胞凋亡的影响 很多肿瘤都有EGFR的过量表达，并使其下游信号途径异样激活, 最终导致细胞出现转化、增殖等现象 10.探讨显示，采纳靶向EGFR

19、基因的药物，能有效抑制EGFR的表达，降低肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡 11-12.如图6所示，转染EGFR DRz之后，G1期细胞比例均有所上升，细胞被阻滞在G0G1期，这与EGFR基因缄默后细胞周期的表现一样13，证明细胞凋亡的确由EGFR DRz所致.结合图7，在转染效率相像的条件下，COS组转染EGFR DRz的细胞凋亡率达到19.3%，高于脂质体组的13%，进一步证明了COS作为基因载体的有效性，也表明COS本身对肿瘤细胞的生长也有肯定的抑制作用.此外，当递送control DRz时， COS组的凋亡率2.49%，仅为脂质体组5.101%的一半，说明COS对细胞的毒性比脂质体更低.

20、图6 流式细胞术分析细胞周期 Fig. 6Cell cycle analysis by Flow Cytometry 图7 流式细胞术分析细胞凋亡 Fig. 7Cell apoptosis analysis by Flow Cytometry 3 结 论 近年来，基于可生物降解的大分子多聚体的药物/基因递送系统的探讨已成为生物医学领域的探讨热点之一.壳寡糖作为一种自然的可生物降解的聚合物，来源丰富，理化性质相对稳定，具有多种生物学活性，已成为被广泛关注的生物医学材料.本文设计合成了靶向EGFR的脱氧核酶，以壳寡糖为递送载体，转染Hela细胞，有效地实现了EGFR DRz的细胞内递送和对目的基因

21、的靶向切割.与经典转染试剂脂质体相比，壳寡糖不但具有与脂质体相同的转染效率，并由于其本身具有抗肿瘤作用，因而对细胞的毒性更低. 因此，壳寡糖作为一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体，不仅为基因治疗供应了一种新的手段，同时其本身所具有的多种生物学特性也丰富了药物/基因载体所发挥的作用. 参考文献 1 LI J,WANG N，LUO Q，et al. The 1023 DNA enzyme generated by a novel expression vector mediate inhibition of taco expression in macrophageJ.Oligonucleotid

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